慢性热应激对西门塔尔牛血清酶活性和免疫功能的影响

陈 浩,王纯洁,斯木吉德,刘 波,敖日格乐* (.内蒙古农业大学 动物科学学院，内蒙古 呼和浩特 0008;.内蒙古农业大学 兽医学院，内蒙古 呼和浩特 0008)

应激(stress)是机体对内部或外界各种非常刺激所产生的非特异性应答反应的总和[1]。动物在整个生产周期内，不断遭受着饲养管理、噪声及温度等因素造成的应激，其中由环境温度变化所导致的冷热应激给畜禽生产带来了极大的危害。奶牛属恒温动物，其单位体质量的散热面积小而导致皮肤蒸发散热困难，且在采食和泌乳等新陈代谢活动中产生大量热量，因此夏季高温季节极易引发奶牛热应激[2]。一般认为，当环境温度超过22℃或温湿指数(THI)大于72时，奶牛处于热应激状态[3]。史彬林等[4]研究发现，当气温达到40℃时，奶牛采食量下降40%。薛白等[5]通过比较不同季节牛乳质量，发现与其他3个季节相比，夏季牛奶中乳蛋白率和乳脂率均出现不同程度的下降。PEREIRA等[6]报道，当日平均气温由33℃上升到41.7℃时，奶牛的受胎率由61.5%下降到31.0%。

环境温、湿度的变化可引起动物血液中炎性因子和免疫球蛋白含量改变，降低动物机体细胞和体液免疫功能，奶牛血清中促炎因子的升高与炎症的发生密切相关[7]。据研究报道指出，热应激可显著降低奶牛血清中免疫球蛋白A(IgA)和免疫球蛋白M(IgM)含量，并显著降低初乳中免疫球蛋白G(IgG)含量[8-9]。张秩凤[10]研究发现，与春季非应激状态相比，夏季高温、高湿环境下奶牛血清中IgG含量极显著下降，肿瘤坏死因子-α(TNF-α)含量极显著升高。

目前关于反刍动物热应激的研究报道主要集中于我国南方高温、高湿条件下热应激对反刍动物的影响。然而近年来的研究结果表明，根据综合指数(CCI)回归公式判定，呼和浩特市和北京市奶牛全年至少分别有144和131 d处于热应激状态[11-12]。此外，目前关于夏季高温对内蒙古草原放牧西门塔尔牛的影响相关研究报道较少。因此，本研究拟以放牧条件下西门塔尔母牛为试验群体，检测试验个体在热应激与非应激状态下的免疫指标和血清酶活性的差异，探讨慢性热应激对西门塔尔牛免疫功能和血清酶活性的影响，筛选可判别热应激反应的血液生化指标，旨在为肉牛抗热应激研究及当地筛选抗热应激个体提供数据支持。

1 材料与方法

1.1 实验动物及饲养管理本试验在内蒙古锡林郭勒盟乌拉盖管理区奥科斯牛场进行，以牧场提供的16头体况健康、体质量相近的西门塔尔母牛为研究对象。全部试验牛均在同一天然草场自然放牧(牧草营养成分见表1)，自由饮水(草场内有天然河流)。试验分为热应激期(2018年7月16日—7月20日)和非应激期(2018年8月26日—8月30日)两个阶段进行。

1.2 CCI测定本试验以天然草场自然放牧的肉牛为研究对象，根据当地气象资料记录的温度、相对湿度和风速，记录日照时间并根据MADER等[13]提出的计算公式计算牧场的CCI。

1.3 血清制备和血液生化指标测定在各试验期最后1 d清晨出牧前，每头试验牛颈静脉采血10 mL，室温静置30 min后，3 500 r/min离心10 min，吸取上清液分装至1.5 mL离心管中，分离出的血清立即置于液氮罐中，带回实验室-20℃保存供测定血清生化指标。白细胞介素-1β(IL-1β)、白细胞介素-2(IL-2)、白细胞介素-4(IL-4)、白细胞介素-6(IL-6)、TNF-α、IgA、IgG、IgM、肌酸激酶(CK)、乳酸脱氢酶(LDH)、谷草转氨酶(AST)、谷丙转氨酶(ALT)、碱性磷酸酶(AKP)测定试剂盒均购自南京建成生物工程研究所，测定过程均严格按照试剂盒说明书进行操作。

2 结果

2.1 牧草营养成分和CCI测定结果综合温湿度、风速和日照时间的CCI是判断肉牛热应激的最准确的指数之一。以CCI作为热应激的评定标准，当CCI>25时牛处于热应激状态。通过对放牧草场温、湿度和CCI的测定，结果显示在试验第1阶段草场最高温度达到40.50℃，CCI在此期间平均高达29.61，表明此阶段的西门塔尔牛遭受热应激侵袭(表2)；而非应激期的平均温度为22.82℃，CCI为20.37,均未达到肉牛产生热应激的临界值；表1结果显示试验期间牧草营养成分无显著变化，符合试验要求，可以进行下一步西门塔尔牛免疫及抗氧化功能比较研究试验。

表1 放牧草场牧草概略养分(干物质基础) %

表2 不同试验期草场温、湿度及CCI

2.2 西门塔尔牛免疫指标测定结果慢性热应激对西门塔尔牛免疫指标影响的测定结果见表3。与非应激状态相比，在热应激状态下，试验牛血清中IL-2、IgA及IgG含量均显著下降(P<0.05)，TNF-α和IL-1β含量显著升高(P<0.05)，但IL-4和IgM含量无显著性差异(P>0.05)。

表3 西门塔尔牛血清免疫指标测定结果 ng/L

2.3 西门塔尔牛血清酶活性测定结果慢性热应激对西门塔尔牛血清酶活性影响的测定结果见表4。与非应激状态相比，在热应激状态下，试验牛血清中CK、LDH、ALT及AST含量显著升高(P<0.05)，但AKP含量无显著变化(P>0.05)。

表4 西门塔尔牛血清酶活性测定结果 U/L

3 讨 论

3.1 慢性热应激的判定及其对西门塔尔牛免疫功能影响奶牛在夏季高温季节极易遭受热应激侵袭，MADER等[3]研究发现，当环境温度超过22℃时，奶牛即出现热应激反应，徐明等[11]通过研究呼和浩特地区奶牛热应激判定，也得出同样结论。THI综合环境温度和相对湿度，常用于判定奶牛遭受热应激程度。INGRAHAM等[14]报道当THI处于72～78时，奶牛处于轻度热应激状态；当THI为79～89时，奶牛将出现中度热应激反应；当THI大于90时，将出现重度热应激反应，极有可能导致奶牛死亡。奶牛活动最适宜的温度范围为-0.5～20.0℃，肉牛生长适宜温度是5～25℃[15-16]。本试验研究结果显示，试验后期草场平均温度为22.82℃，CCI为20.37，没有达到牛产生热应激的临界值，因此试验牛在试验后期处于非应激状态；试验前期牛舍内平均温度为33.59℃，CCI达到29.61，已超出牛产生热应激的临界值，试验牛处于热应激状态。

动物机体免疫系统由免疫器官、免疫分子和免疫细胞组成，免疫分子包括免疫球蛋白、白细胞介素、肿瘤坏死因子和干扰素等，机体可通过血液循环将免疫分子运送到全身，执行免疫防御和维持内环境稳定等功能。IL-2是T淋巴细胞受抗原刺激时分泌的淋巴因子；IL-1β、TNF-α和IL-4作为促炎症因子，可导致炎症反应，其浓度的升高和奶牛炎症反应有极大的相关性，且前者可调节多种免疫系统反应[17-19]。免疫球蛋白是一类具有抗体活性的球蛋白，是动物机体内免疫系统的重要组成成分，IgA、IgG和IgM可在机体特异性免疫中发挥重要作用[20]。WU等[21]研究发现动物机体内免疫球蛋白含量的高低可能取决于应激强度、持续时间以及动物品种和体况。据研究发现，不同持续时间的热应激均可导致山羊血清中IgA、IgG和IgM含量显著降低，这表明在高温环境下，山羊机体的免疫功能受到抑制，严重损害其体液免疫[22-23]。同样热应激可使肉牛血清中IgG含量显著下降[24]。IgG是免疫球蛋白的主要成分，约占血清中免疫球蛋白总浓度的75%，其含量的高低可体现机体体液免疫的状况[25]。CARROLL等[26]研究发现热应激状态下，安格斯牛血液中的TNF-α升高，热应激可导致肉牛发生炎症反应。PELI等[27]报道夏季热应激后导致犊牛血清中IL-4含量由3.3 ng/L显著上升到7.4 ng/L。本试验研究发现，热应激状态下西门塔尔牛血清中IL-1β、IL-2和TNF-α含量显著高于于非应激期，表明持续热应激导致西门塔尔牛发生了炎症反应。热应激条件下西门塔尔牛血清中IgA和IgG含量显著低于非应激期，表明西门塔尔牛在夏季遭受持续高温刺激，导致其机体的免疫组织和功能遭到损害，体液免疫受到抑制。

3.2 慢性热应激对西门塔尔牛血清酶活性的影响血清中的酶大部分来自机体的组织器官，酶是调节动物机体新陈代谢的催化剂，动物在健康生理状况时，由于细胞膜的屏障作用，细胞内的酶不易逸出，当机体遭受应激导致细胞损伤时，细胞膜的通透性增加，细胞内的酶释放进入血液，导致血清中酶含量增多，因此血清酶活性可作为判定动物组织器官健康状况和应激反应程度的重要指标[28]。AKP广泛的存在于动物体内的肝、胰等组织器官中；ALT和AST是机体氨基酸代谢过程中的两种重要的转移酶，主要存在于肝细胞和心肌细胞中，当细胞受损时会逸出到血液中；LDH主要存在于心肌细胞的胞质液中，当动物机体组织发生病变时，机体的糖代谢过程由有氧氧化转化为无氧酵解时，血液中LDH活性增加[29]。CK主要存在于骨骼肌和心肌中，与机体内能量运转和ATP再生有密切关系，且其含量的高低可反应应激对机体内组织细胞的损伤程度[30]。何钦[31]研究表明，在热应激条件下，不同泌乳阶段奶牛血清CK活性均出现不同程度的升高，且随着热应激程度的增加，各泌乳阶段奶牛血清CK活性均有升高趋势。刘庆华等[32]报道热应激状态下，荷斯坦奶牛和娟—荷奶牛血清中AKP、AST及ALT活性均显著升高。但蔡明成[33]通过热应激对肉牛血清酶活性研究，发现热应激对肉牛血清AST和ALT活性无显著影响，可能因为血清酶活性由多种途径调控。本试验研究发现，热应激期间西门塔尔牛血清中CK、AST和ALT活性显著高于非应激期，这表明高温引起的热应激对西门塔尔牛肝脏造成了一定的损伤，且对其组织细胞的供能造成了一定的影响。此外，热应激导致西门塔尔牛血清中LDH活性显著升高，可能某些组织器官已发生病变，机体能量代谢受到限制，但具体作用过程还需进一步探讨研究。本试验条件下，慢性热应激可造成放牧西门塔尔母牛免疫功能下降，导致其患病风险升高。