口腔白斑癌变DNA损伤修复相关基因的芯片检测及表达验证

刘 伟，朱敏闻，吴 岚

1.上海交通大学医学院附属第九人民医院·口腔医学院口腔颌面头颈肿瘤科，国家口腔疾病临床研究中心，上海市口腔医学重点实验室，上海市口腔医学研究所，上海200011；2.上海市徐汇区牙病防治所口腔外科，上海200032；3.上海交通大学医学院附属第九人民医院·口腔医学院口腔黏膜科，国家口腔疾病临床研究中心，上海市口腔医学重点实验室，上海市口腔医学研究所，上海200011

口腔白斑（oral leukoplakia，OL）是口腔黏膜的潜在恶性疾病之一，是口腔鳞状细胞癌（鳞癌）的主要来源［1］。调查［2-4］显示，国内OL患者的癌变率为4%～18%。上皮异常增生是OL 的病理特征。白斑的发生发展到癌变的进程各阶段较明确，是从上皮无异常增生、上皮单纯增生、轻度异常增生、中度异常增生、重度异常增生到癌变的过程，因此成为口腔癌发生发展的良好研究模型。目前普遍认为口腔癌的发生是由遗传学、生物学和物理化学等多种因素综合作用所导致，这些因素造成了基因的突变或缺失、异常扩增和表达［5-7］。为维持基因组的稳定性，机体会自动启动对DNA 损伤的多种修复途径，统称为DNA 损伤修复［5］。因此，检测DNA 损伤修复因子的基因表达或相关生化特性，可能可以为白斑癌变的早期诊断及分级治疗提供新策略。

组蛋白2A 变异体家族成员X（histone variant H2A family member X，H2AX）和共济失调毛细血管扩张症突变基因（ataxia-telangiectasia mutated，ATM） 是公认的DNA 损伤修复特征性基因，两者共同参与细胞内对于DNA 双链断裂损伤修复的快速敏感的反应［8］。H2AX 是DNA损伤应答中的重要效应分子之一，ATM能在DNA断裂点附近丝氨酸残基处磷酸化H2AX 形成磷酸化H2AX（γ-H2AX），ATM活化会进一步激活γ-H2AX，磷酸化修饰会启动DNA 修复和激活检查点的相关途径，从而阻止细胞周期的进展［9］。鉴于白斑癌变与DNA 损伤修复的研究报道较少［10-11］，本研究拟利用人转录组芯片研究OL患者病损发生发展中DNA 损伤修复的相关基因表达谱，随后验证H2AX和ATM的表达。

1 对象与方法

1.1 研究对象及样本收集

本研究共纳入17 例研究对象，其中正常口腔黏膜患者3 名、OL 患者8 名、口腔早期鳞癌（T1-2N0M0）患者6名。研究对象均来源于2014年9—12月上海交通大学医学院附属第九人民医院口腔颌面头颈肿瘤科和口腔黏膜科就诊患者。收集研究对象的人口学资料，包括年龄、性别、是否吸烟和是否饮酒。所有研究对象术前均未进行化学治疗（化疗）、放射治疗（放疗）及激素等治疗手段，且无自身系统性疾病和癌症史。

研究对象的组织样本为活检或手术后标本，放入装有RNAlater 液的冻存管，于液氮浸没15 min，放入-80 ℃冰箱保存。OL 的病理学诊断为上皮单纯增生、轻度异常增生、中度异常增生和重度异常增生白斑。以上诊断由上海交通大学医学院附属第九人民医院口腔病理科医师根据WHO 组织病理学诊断标准［12］确认。本研究将上皮单纯增生和轻度异常增生合并为低危白斑，中度异常增生和重度异常增生合并为高危白斑。本研究获得上海交通大学医学院附属第九人民医院伦理委员会批准。研究对象均签署知情同意书。

1.2 细胞

人口腔鳞癌细胞系HN13 和OL 细胞系Leuk1 由上海交通大学医学院附属第九人民医院口腔肿瘤实验室提供。人正常口腔黏膜角化细胞株HOK 购自北京北方生物技术研究所。

1.3 主要试剂及仪器

TRIzol 试剂（Invitrogen，美国），NanoDrop 2000 分光光度计（Thermo Scientific，美国），DMEM 培养基（D5546， Sigma-Aldrich， 美 国）， KSFM 培 养 基（Lot1646135，Gibco Island，美国），RPMI-1640 培养基（Thermo Scientific， 美 国）， 荧 光 定 量 PCR 仪（LightCycler®480 Ⅱ型，Roche，瑞士）。

1.4 研究方法

1.4.1 组织样本的RNA 抽提 按照TRIzol 试剂常规提取OL、早期口腔鳞癌组织标本和正常口腔黏膜组织样本的总RNA。利用NanoDrop 2000 分光光度计测定浓度及吸光度比值［D（260 nm）/D（280 nm）］，比率大于1.8为合格，使用琼脂糖凝胶电泳检测RNA 完整性。纳入本研究的组织样本经NanoDrop ND-2000 定量并经Agilent Bioanalyzer 2100（Agilent Technologies）检测RNA 完整性， 检 测 显 示RNA 的 吸 光 度 比 值［D（260 nm）/D（280 nm）］比率均在1.8 以上，显示RNA 质量良好，符合实验要求。

1.4.2 转录组芯片研究及数据分析 转录组芯片研究按照Affymetrix GeneChip®Human Transcriptome Array（HTA）2.0 标准流程执行。采用Affymetrix GeneChip Command Console 软件处理提取原始数据和Expression Console 软件对芯片进行gene level 的标准化，标准化算法为Robust Multi-array Average（RMA）。后续分析基因表达使用的软件为Genespring软件。差异基因利用t检验的P值和差异倍数（fold change，FC）的对数（log2FC）的绝对值进行筛选。筛选的标准为|log2FC|≥2.0且P＜0.05。接着，对差异基因进行基因本体数据库（Gene Ontology，GO）富集分析，以判定差异基因主要影响的生物学功能。

1.4.3 细胞培养 HN13 使用DMEM 高糖培养基培养，Leuk1 使用KSFM 培养基人角化上皮细胞培养基培养，HOK 使用含15%胎牛血清的RPMI-1640 培养。所有细胞培养均置于37 ℃、5%CO2及饱和湿度的培养箱内。参照美国模式菌种积存库（American Type Cell Culture，ATCC）提供的标准培养条件培养细胞，细胞生长至70%～80%时用于接种。

1.4.4 实时定量PCR 验证基因表达 提取上述细胞总RNA， 反 转 录 成 互 补DNA （complementary DNA，cDNA）。利用QuantiFast®SYBR®Green PCR Kit试剂盒在荧光定量PCR 仪上进行实时定量PCR （real-time quantitative PCR，qPCR） 反应。体系：SYBR®Premix Ex Taq，10 μL；引物0.4 μL （表1）；cDNA，1 μL；ddH2O，7.8 μL。PCR 程序：95 ℃5 min；95 ℃10 s，60 ℃30 s，40 个循环。采用2-ΔΔCT法测定相对表达水平，实验重复3次。

表1 qPCR验证ATM和H2AX基因的引物序列Tab 1 Primer sequence for ATM and H2AX genes by qPCR

1.4.5 蛋白质印迹法验证蛋白表达 提取上述细胞总蛋白，加入RIPA 裂解液及蛋白酶抑制剂，置于冰上裂解30 min，加入loading-buffer 及二巯基乙醇；加样品于10%SDS-PAGE 电泳分离蛋白样品，ATM 蛋白350 mA恒流转膜2.5 h，γ-H2AX 蛋白90V 恒压1 h，PVDF 膜用3%脱脂奶粉封闭1 h，分别加入ATM 和γ-H2AX 一抗4 ℃孵 育12 h；TBST 漂 洗3 次，10 min/次；加 入 二 抗37 ℃孵育1 h，TBST 漂洗3 次，10 min/次；超敏型ECL发光液显示阳性条带，在Typhoon 系统上扫描结果，Image J 软件分析灰度值，以β-tubulin 为内参，实验重复3 次。

1.5 统计学方法

采用SPSS 17.0 统计软件进行分析，使用GraphPad 6.0 作图。定量资料用±s 表示，正常黏膜、白斑和鳞癌3组间基因定量表达均数差别采用方差分析比较。定性资料以频数表示，采用χ2检验分析。P＜0.05 表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 研究对象人口学资料比较

正常黏膜、白斑和早期鳞癌3组患者的年龄、性别等人口学资料间差异均无统计学意义（表2）。

表2 3组研究对象人口学资料比较Tab 2 Comparison of demographic data between the three groups

2.2 白斑发生发展中的DNA损伤修复基因表达谱

本研究将OL 发生发展的节点分为低危白斑、高危白斑和早期鳞癌。经Affymetrix HTA 2.0 转录组芯片检测，低危白斑与正常黏膜之间有855个|log2FC|≥2.0的基因，高危白斑与低危白斑有399个|log2FC|≥2.0的基因，早期鳞癌与高危白斑有797 个|log2FC|≥2.0 的基因（均P＜0.05）。将白斑各阶段的差异基因进行GO 功能分析。按照GO 生物学作用分类，筛选出生物学作用为DNA 损伤与修复相关的基因（图1），从正常黏膜发展到低危白斑有7 个|log2FC|≥2.0 的基因，从低危白斑发展到高危白斑有7 个，从高危白斑发展到鳞癌有52个（图2）。

2.3 DNA损伤修复关键基因的mRNA表达验证

本研究验证芯片中从正常黏膜到低危白斑的H2AX基因和从高危白斑发展到早期鳞癌的ATM 基因，选择人正常黏膜HOK、白斑Leuk1 和鳞癌HN13 细胞系对ATM 和H2AX行qPCR的验证表达研究。结果（图3）显示β-actin在3 组细胞中表达稳定，统计分析显示ATM 和H2AX 的mRNA 相对表达量在3 组有显著差异，且均呈阶梯式升高。

2.4 DNA损伤修复蛋白ATM和γ-H2AX表达验证

通过蛋白质印迹法（Western blotting）检测ATM 和γ-H2AX 在HOK 细胞、Leuk1 细胞和HN13 细胞中的蛋白表达水平。结果（图4）显示：内参蛋白β-tubulin 在3 组细胞系中的表达量一致；相对于HOK 细胞，ATM 蛋白在Leuk1 细胞中的表达明显增高，而在HN13 细胞中的表达量明显降低，且是3 种细胞中表达最弱的；γ-H2AX 蛋白在Leuk1 细胞中的表达量略增加，在HN13 细胞中的表达量明显上调。

图1 从白斑发生发展各阶段的全部基因中筛选出DNA损伤修复基因Fig 1 DNA damage repair genes were screened from all genes in the development and progression of leukoplakia

图2 口腔早期鳞癌与高危白斑之间的52个差异基因聚类热图Fig 2 Clustering heat map of 52 different genes between oral early squamous cell carcinoma and high-risk leukoplakia

图3 qPCR验证ATM和H2AX在人正常黏膜、白斑和鳞癌细胞系中的差异表达Fig 3 qPCR confirmed the differential expression of ATM and H2AX in normal mucosa,leukoplakia and squamous cell carcinoma cell lines

图4 Western blotting检测ATM和γ-H2AX在HOK细胞、Leuk1细胞和HN13细胞中的表达Fig 4 Western blotting examined the protein expression of ATM and H2AX in HOK cells,Leuk1 cells and NH13 cells

3 讨论

口腔黏膜白斑癌变的进程是由多个异常基因参与的组织结构和细胞功能改变的多步骤过程，高危白斑及其癌变的早期诊断及干预对改善预后尤为重要［12］。以往对白斑的芯片研究，仅仅设置了2 组对照研究，如王娟等［13］对口腔正常黏膜（n=3） 和白斑（n=3） 进行的Affymetrix U133 plus 2.0 基因芯片研究，张德保等［14］对正常黏膜（n=10）和白斑（n=10）进行的Agilent 基因组学芯片，陈显久等［15］对白斑（n=3）和鳞癌（n=3）进行的SupperArray 基因芯片研究。 而本研究选取的Affymetrix HTA 2.0 芯片包括近700 万条探针，可检测超过28 万条全长转录本。纳入转录组芯片的阶梯式病例设置是本研究的特色。针对白斑的发生发展，本研究共设置4组病例模拟白斑癌变的多步骤进程，包括正常黏膜组（n=3）、低危白斑组（n=4）、高危白斑组（n=4）和早期鳞癌组（n=6），研究结果可反映白斑癌变不同阶段的基因组学特性。

DNA 损伤修复功能的异常是肿瘤发生发展的机制之一，其中DNA 双链断裂伴随细胞周期检查点的激活在其中发挥重要作用［16］。本研究中转录组芯片筛选出白斑发生发展各阶段的DNA 损伤修复相关基因，从正常黏膜到低危白斑的常见异常基因有CD44、鼠双微体基因2（murine double minute 2，MDM2）和γ-H2AX 等，从高危白斑发展到早期鳞癌的常见异常基因有胱天蛋白酶3（cysteine aspartic acid specific protease，CASP3）、细胞周期检测点激酶1（check point kinase 1，CHK1）、周期蛋白 依 赖 性 激 酶2 （cyclin dependent kinase，CDK2） 和ATM 等。本研究显示，共济失调毛细血管扩张突变基因Rad3 相关蛋白（ataxia-telangiectasia mutated and Rad 3 related protein，ATR）在高危白斑发展到鳞癌有差异表达，但并未检测发现明确的CHK2 和ATR2 差异表达，这提示参与DNA 单链断裂的损伤修复基因有待于进一步研究。段宁等［17］对白斑（n=4）和鳞癌（n=4）进行单核苷酸多态性芯片研究，异常基因主要位于第3、5～9、11、13～15、17、18 染色体，本研究筛选出的DNA 损伤修复基因位点亦多位于这些染色体。

本研究结果显示，H2AX的mRNA 和蛋白表达水平在HOK 细胞、Leuk1细胞和NH13细胞中逐步上调，并存在组间显著差异，与芯片筛查结果基本相符。该结果提示正常上皮细胞处于相对静止状态，H2AX 基因的表达水平很低，但当DNA 损伤双链断裂形成后，其mRNA 表达量会迅速上升，并磷酸化形成γ-H2AX，在转录后的蛋白水平表达增强。因此，H2AX 及其磷酸化应该是识别白斑发生发展中DNA损伤的早期事件之一［18］。

本研究对ATM 的qPCR 实验结果显示，ATM 的mRNA 在HOK 细 胞、Leuk1 细 胞 和NH13 细 胞 中 逐 步 上调，并存在组间显著差异，与芯片筛查结果基本相符。Western blotting 实验结果显示，ATM 蛋白相对于HOK 细胞在Leuk1 细胞中表达升高，但在NH13 细胞中明显降低；该结果提示ATM 蛋白的过表达是出现在癌变之前的白斑阶段，但在癌变之后的鳞癌中其表达降低，这与ATM 在眼咽型肌营养不良（oculopharyngeal muscular dystrophy，OPMD）和鳞癌中免疫表达结果相符［19］。一般认为，一个有效的DNA 损伤修复机制能确保修复顺利及时完成，维持基因组稳定性，它是癌症发生的保护屏障［10］。但在癌症发生时，如果ATM 无法完全修复DNA损伤，则会造成损伤的DNA 双链积聚，则最终将促进癌症的发生。ATM 在白斑癌变进程中基因表达上调和蛋白表达下降结果不一致的原因可能是，DNA 损伤程度超出了ATM 的修复能力范围或受到其他非编码RNA 调控以致ATM 蛋白失活，导致DNA 损伤积累增加细胞恶性转化程度；这与Tu 等［19］利用免疫组织化学研究ATM 在口腔癌前病损和鳞癌组织中的表达研究结果相一致。因此，ATM蛋白失活可能是白斑癌变的早期事件之一。

目前，DNA 损伤修复基因在口腔癌变进程中的分子机制研究很少［20］。本研究结果提示，ATM 和H2AX 等基因的异常改变在白斑发生发展中具有重要作用，白斑癌变微环境中ATM 和H2AX 等的信号通路和分子机制值得进一步研究。综上，本文通过研究DNA 损伤修复的基因表达谱，为深入研究OL 的发生发展机制、筛查标志性癌变基因、寻找OL早期诊断的分子标记提供了参考。