我国猪急性腹泻综合征冠状病毒研究进展

田昊伦，范志新，孙 颖，王 凯，冯全文，郭抗抗 (西北农林科技大学 动物医学院，陕西 杨凌 712100)

冠状病毒(coronavirus，CoV)属于尼多病毒目(nidovirales)、冠状病毒科(coronaviridae)冠状病毒属(coronavirus)，是一种具有囊膜、基因组为线性单股正链的RNA病毒[1]。根据国际病毒分类委员会(ICTV)将冠状病毒可分为α，β，γ和δ 4个属。冠状病毒宿主范围广泛，可感染人类、鸟类和哺乳类动物，引起不同严重程度的呼吸道和胃肠道疾病[2]。截至目前，已经有3种猪肠道冠状病毒被鉴定出，即猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(transmissible gastroenteritis virus,TGEV)和猪δ冠状病毒(porcine deltacoronavirus,PDCoV)被确定是诱发初生仔猪病毒性腹泻的主要病原，然而2017年在中国南部猪群中发现了第4种猪肠道冠状病毒，即猪急性腹泻综合征冠状病毒(swine acute diarrhea syndrome coronavirus,SADS-CoV)。SADS-CoV能够引起严重的猪急性腹泻综合征(swine acute diarrhea syndrome,SADS)，感染仔猪临床表现为严重水样腹泻、剧烈呕吐，最终因严重脱水体质量减轻而死亡，给养猪业造成极大的经济损失[3]。因此，本研究将从SADS-CoV的病原学、流行病学、诊断方法以及防控等方面进行综述，以期为SADS的防控提供参考。

1 SADS-CoV的起源和发现

2017年1月，中国广东省的猪群中新生仔猪暴发严重致死性腹泻，临床体征包括急性呕吐、水样腹泻和体质量迅速下降，然而在采集的所有临床样品中，均未检测出与猪腹泻相关病毒，包括PEDV、TGEV和PDCoV。研究人员进一步通过病原的分离和细胞培养，发现此次造成仔猪突发致死性腹泻的病原，竟是一种新型的猪肠道冠状病毒，并将其命名为SADS-CoV，也有研究小组将其称为猪肠道甲型冠状病毒(swine enteric alphacoronavirus，SeACoV)，或猪肠道α冠状病毒(porcine enteric alphacoronavirus，PEAV)[3-5]。研究发现，SADS-CoV病毒与2007年中国香港和广东省报道的中华菊头蝠冠状病毒HKU2全基因组同源性达95%，暗示SADS-CoV可能来源于蝙蝠。随后进一步研究发现SADS-CoV与2016年在发病猪场附近的一个蝙蝠洞穴中检测出的蝙蝠冠状病毒基因组序列高度相似，同源性达98.48%，证实SADS-CoV是一种起源于蝙蝠的新型冠状病毒[3,6]。

2 流行概况

回顾性调查研究表明，至少从2016年8月份开始，SADS-CoV在广东省清远和韶关地区猪场中就已经出现[7]。2017年1月12日，广东省清远市的一家猪场暴发SADS疫情，临床主要表现为呕吐和重度腹泻，发病仔猪可见体型消瘦和厌食，5日龄以内的仔猪死亡率高达90%，随后在方圆20～150 km 范围内的其他3个猪场中也迅速暴发SADS，截止到2017年5月2日，该疾病已导致4个猪场24 693头仔猪死亡，短短几个月给养猪业造成了巨大经济损失[3]。然而，从2017年5月至2019年1月，广东省再没有出现SADS疾病大规模暴发的相关报道。2017年ZHANG等[8]从福建省养猪场采集的68份仔猪腹泻样品中检测出SADS-CoV阳性率为10.29%(7/68)。2018年，LI等[9]对中国福建省7个农场采集的腹泻仔猪粪便和小肠样品进行检测，并成功分离得到1株SADS-CoV病毒，进一步说明SADS-CoV可能已经从广东省传播到福建省。2019年2月，广东省一家养猪场大约2 000 头仔猪暴发严重急性腹泻，发病仔猪临床表现急性水样腹泻和呕吐，并在腹泻2～6 d后死亡，这与之前研究报道SADS暴发的临床特征相似，经过病原学和血清学诊断后确认了此次仔猪大规模急性腹泻暴发的病原是SADS-CoV[10]。目前，国内仅在广东省和福建省发现了SADS-CoV，国外对本病尚无相关报道。

3 病原学

3.1 SADS-CoV的基本特征SADS-CoV属于冠状病毒科(coronaviridae)、α冠状病毒属(alphacoronavirus)，是一种有囊膜、单股、正链RNA病毒，具有典型的冠状病毒结构，病毒表面具有突起，电镜下病毒颗粒直径为100～120 nm[11]。

3.2 基因组结构SADS-CoV基因组全长约27 kb，与蝙蝠冠状病毒HKU2在全基因组水平上具有95%的核苷酸同源性，G+C含量约为39%[5]。基因组两端是5′非编码区(utranslated region，UTR)和3′UTR，从5′端起2/3区域是由开放阅读框ORF1a和ORF1b编码的2个复制酶多聚蛋白(pp1a和pp1ab)，基因组剩余的1/3区域编码4种主要的结构蛋白：包括纤突蛋白(S)、核衣壳蛋白(N)、膜蛋白(M)和小膜蛋白(E)，这些结构蛋白都是构成完整病毒颗粒所必需的。在结构蛋白之间或内部还包含一些辅助蛋白，如在S基因和E基因之间存在的ORF3基因，该基因编码1个大小为229个氨基酸的辅助蛋白(NS3)，在3′ 端基因组N基因之后还存在1个ORF，编码辅助蛋白(NS7a和NS7b)，但其具体功能尚不清楚[3]。进一步研究发现，与蝙蝠冠状病毒HKU2相比，SADS-CoV基因组的ORF3、S及M基因3处位点均有核苷酸的缺失或插入[4]。另外，SADS-CoV每个ORF前端都有一致的转录调控序列TRS，即5′-AACUAAA-3′，与蝙蝠冠状病毒HKU2的TRS序列相同[12]。

S蛋白是SADS-CoV最大的结构蛋白，由1 130个氨基酸编码。SADS-CoV和蝙蝠冠状病毒HKU2的S蛋白氨基酸同源性为86.4%，但是N端结构域(NTD)只有67.4%的同一性，主要集中在SADS-CoV的S蛋白N端结构域(NTD)的1～238位氨基酸存在高度变异，该区域有75个氨基酸置换以及2个氨基酸插入。值得注意的是，蛋白结构同源性建模结果分析显示，S蛋白中S1亚基的N端结构域(NTD)在结构上与α冠状病毒属的人类冠状病毒NL63相似，而S1亚基其余部分以及S2亚基在结构上接近于β冠状病毒属的鼠肝炎病毒(mouse hepatitis virus,MHV)，是一种较为独特的结构蛋白。研究推测S蛋白N端结构域(NTD)的高度变异，可能导致从蝙蝠冠状病毒HKU2变异为SADS-CoV，从而跨种属从蝙蝠传播到猪[4]。FU等[12]在SADS-CoV病毒S蛋白的546和673 aa处发现2个蛋白切割位点，分别是S1/S2(VRR↓MTFE)和S2'(ESR↓SAIEDLLF)，其次在S2亚基的C端区域发现了S蛋白的跨膜结构域1 069～1 091 aa，在S2亚基的C末端还存在短的细胞质结构域，其中含有保守的半胱氨酸残基。胞质内结构域中半胱氨酸的棕榈酰化，对于调节S蛋白与宿主细胞膜的融合至关重要[13]。

核衣壳N蛋白是结合在病毒RNA上的结构蛋白，在病毒装配及转录中发挥着重要作用，根据N蛋白的特异性单克隆抗体追踪发现，SADS-CoV的N蛋白主要定位于感染细胞的胞质以及核仁中，通过对N蛋白抗原表位探究，进一步发现N蛋白的最小B细胞表位为343～351位氨基酸残基(DAPVFTPAP)[14]。鉴于N蛋白高度保守，通常作为SADS-CoV早期诊断的靶蛋白[15]。

3.3 SADS-CoV的培养特性SADS-CoV能够在猪回肠上皮细胞(IPI-2I)、猪肾上皮细胞(LLC-PK)、非洲绿猴肾细胞(Vero)上生长增殖，并产生典型的细胞病变(cytopathic effect，CPE)，主要表现为细胞皱缩、变圆、融合形成合胞体并伴有脱落。在SADS-CoV的分离培养过程中，通过在细胞培养基中添加一定量的胰酶，可以显著提高病毒的滴度。若培养基中不添加胰酶，病毒仍可以在LLC-PK和Vero中复制增殖并引起CPE，但病毒的滴度较低。通过qRT-PCR分析发现，在补充有胰酶的SADS-CoV感染细胞中具有较高水平的病毒载量。上述结果表明胰酶的添加有助于病毒的感染增殖，可能通过对S蛋白的水解进而促使病毒与膜受体结合，有利于病毒进入宿主细胞[16-17]。

3.4 病毒的致病性各年龄段猪对SADS-CoV均易感，但以初生乳猪的危害最大，病死率也最高。在最近的一项研究中，XU等[18]用SADS-CoV感染细胞的培养液对新生仔猪进行人工感染，12只新生仔猪每头经口饲喂5 mL含有5×105TCID50的病毒液，在刚开始4 d内仅表现出轻度腹泻，随后的1周内开始出现剧烈腹泻，并伴有呕吐，最后因重度脱水导致10头仔猪死亡，而对照组没有仔猪死亡；通过qRT-PCR对收集的感染仔猪直肠粪便拭子进行检测，结果从感染后2 d的粪便中就检测到了病毒RNA。将鉴定为SADS-CoV阳性肠组织剪碎匀浆后，取组织匀浆液人工感染7头无特定病原体SPF仔猪，在感染后2 d，7只仔猪中有3只死亡。在另1组人工感染试验中，来自无腹泻病农场的6只健康仔猪，接种SADS-CoV的细胞培养物后，在感染后2～4 d内，感染组仔猪均出现重度腹泻，体质量急剧下降，最终导致3头仔猪死亡，而对照组仔猪均存活[3]。

SADS-CoV感染仔猪小肠主要病理特征表现为肠壁变薄且透明，含有大量黄色水样稀粪，盲肠和结肠内容物也呈水状，无色素沉着，肠系膜充血明显并伴有个别出血点。通过病理组织学发现，SADS-CoV主要破坏肠道绒毛上皮细胞，导致肠绒毛逐渐变钝和萎缩，细胞核溶解脱落，黏膜炎性细胞增多，绒毛间黏附较严重[19]。随感染时间的增加，小肠绒毛逐渐萎缩，隐窝深度增加，小肠绒毛高度与隐窝深度的比值显著降低，尤其是空肠和回肠的病变表现更为突出，导致小肠黏膜结构的完整性和肠道屏障功能被严重破坏，继而影响肠道营养物质的吸收[4]。尽管SADS-CoV主要感染肠道组织，通过qRT-PCR技术对不同组织中带毒情况探究，发现不仅在肠道组织(如十二指肠、空肠、回肠、盲肠和结肠)中检测到SADS-CoV病毒RNA，而且在心脏、肝脏、脾脏、肾脏、胃和肺中也检测到该病毒，表明SADS-CoV具有广泛的组织嗜性，因此有必要进行更详细的发病机制研究，以了解病毒在体内的复制机制[18]。

3.5 致病机理天然免疫应答是机体防御病原入侵的第一道防线，在抗病毒免疫反应中，Ⅰ型干扰素(IFN-α/β)发挥着重要作用。在病毒感染早期，宿主细胞可以通过模式识别受体(如Toll样受体和RIG-Ⅰ样受体)识别病原后，能够介导一系列信号途径被激活诱导干扰素生成。视黄酸诱导基因Ⅰ(RIG-Ⅰ)为RLRs受体家族的成员，是细胞内重要的模式识别受体，主要通过识别细胞质中的病毒RNA，并向下游传导信号诱导Ⅰ型干扰素表达，在宿主的天然免疫应答中发挥着重要作用[20]。最近研究发现，SADS-CoV能够逃避RIG-Ⅰ介导的天然免疫反应，在感染猪肠道上皮细胞(IPEC-J2)后，抑制Ⅰ型干扰素IFN-β合成[21-22]。与PEDV和PDCoV的免疫逃逸机制相似，SADS-CoV主要通过与受体蛋白RIG-Ⅰ以及下游衔接分子IPS-1相互作用，抑制IFN-β启动子的活化，干扰RIG-Ⅰ介导的信号通路，阻碍细胞转录因子IRF-3和NF-κB的磷酸化和核易位，进而使得转录因子IRF-3和NF-κB与IFN-β启动子结合并启动IFN-β的转录受到限制，导致β干扰素IFN-β的表达受阻[23]。

细胞凋亡也是宿主细胞重要的抗病毒防御机制，在凋亡过程中细胞被分割包裹成几个凋亡小体，进而被吞噬细胞吞噬，从而限制了病毒感染。近年来，已发现一些冠状病毒在感染周期中能够诱导细胞凋亡，促进病毒的释放和入侵[24-25]。研究发现,SADS-CoV感染宿主细胞后能够激活死亡受体介导的外在凋亡途径和线粒体介导的内在凋亡途径。细胞膜上的死亡受体和线粒体激活后，将细胞凋亡因子/信号进一步加工传递至半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(Caspase)家族，启动Caspase级联反应，最终激活内在和外在凋亡途径的主要执行酶Caspase-3，降解DNA修复酶PARP(poly ADP-ribose polymerase，PARP)使其丧失修复DNA的功能，引起细胞凋亡。值得注意的是，SADS-CoV通过感染诱导靶细胞凋亡可以有效促进病毒在细胞内的复制；而当通过添加半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(Caspase)抑制剂抑制依赖Caspase的凋亡途径，或者使用抑制剂(环孢霉素A)抑制在线粒体内膜中构成线粒体膜通透性转换孔(mitochondrial permeablity transition pore，mPTP)复合物中的亲环蛋白D(CypD)的活性，进而影响线粒体的通透性阻断内在凋亡途径时，发现SADS-CoV诱导的细胞凋亡被抑制剂所阻断，SADS-CoV的感染也被显著抑制，表明细胞凋亡是SADS-CoV病毒复制所必须的[26]。

4 SADS-CoV的诊断方法

由于PEDV、TGEV、PDCoV和SADS-CoV等肠道冠状病毒引起的腹泻病，在临床症状和组织病理变化上都很相似，临床上难以进行区分鉴别，因此必须通过实验室方法进行确诊。目前，SADS-CoV 的诊断方法主要有实时荧光定量RT-PCR、普通RT-PCR、病毒分离培养、免疫荧光(immunofluorescence，IF)、免疫组织化学(immunohistochemistry，IHC)等。病毒分离培养一直被认为是检测和诊断病毒性疾病的金标准，但其鉴定周期较长；免疫荧光(IF)和免疫组织化学(IHC)检测需要针对抗原的特异性抗体和荧光标记抗体，过程耗时耗力且程序繁杂。

反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)是一种实验室常用的分子检测方法，具有耗时短、敏感性和准确度高等优点。目前,该检测技术已经被广泛应用，主要包括普通RT-PCR、套式RT-PCR、实时荧光定量RT-PCR、多重RT-PCR等。张誉瀚等[27]根据N基因设计2对特异性套式引物，建立1种SADS-CoV的套式RT-PCR检测方法，相比于普通PCR方法，套式PCR经过2轮扩增极大减少了引物的非特异性扩增，从而增加了特异性扩增，提高扩增效率和灵敏度，最低检测浓度达102拷贝/μL，适用于临床快速准确检测。ZHOU等[28]根据SADS-CoV的N基因的保守区域设计特异性引物和探针，建立了TaqMan探针RT-qPCR方法。通过对174份腹泻仔猪的临床样本进行检测，结果显示采用荧光定量RT-PCR方法SADS-CoV的阳性检出率为70.69%(123/174)，而普通PCR阳性检出率仅为51.15%(89/174)。该方法较普通PCR灵敏度高，而且不会与其他猪源病毒(如CSFV、PRRSV、PEDV等)发生交叉反应，具有较强的特异性。MA等[29]针对SADS-CoV的M基因设计引物并建立了SYBR Green的RT-qPCR技方法，对比试验表明，其检测灵敏度高于普通RT-PCR，基于SYBR Green的RT-qPCR方法和常规RT-PCR的84个临床样品的阳性率分别为73.81%(62/84)和53.57%(45/84)。为开发一种简便、快速、准确的猪肠道冠状病毒的鉴别诊断方法，HUANG等[30]成功建立了能鉴别PEDV、TGEV、PDCoV和SADS-CoV等4种病毒的TaqMan探针多重RT-PCR方法，为检测猪肠道冠状病毒提供了一种高效方法。

逆转录环介导等温扩增技术(RT-LAMP)具有耗时短、灵敏度高、操作简便等优势，一般在63°C恒温下60 min即可完成扩增反应。WANG等[31]根据建立的SADS-CoV实时RT-LAMP检测方法，从24份临床样品中鉴定出20份SADS-CoV阳性样品，与实时RT-PCR具有相当的诊断敏感性，灵敏度可达1.0×10拷贝/μL，RT-LAMP检测法可以应用于临床中SADS-CoV的早期快速诊断。以上建立的检测方法可以为SADS-CoV的病原学诊断和流行病调查提供重要理论依据和技术支撑。

5 SADS-CoV潜在的跨物种传播风险

目前，除猪和蝙蝠外，SADS-CoV对其他动物宿主和人畜共患的感染潜力仍然未知。YANG等[17]研究发现SADS-CoV在体外具有广泛的物种嗜性，能够感染源自多种动物的细胞系，包括啮齿动物、猪、鸡、非人类灵长类动物细胞系，尤其对啮齿类动物(大鼠、小鼠、沙鼠、仓鼠)细胞系均表现出易感性。而且，在建立的SADS-CoV感染小鼠模型中发现，尽管小鼠仅表现出亚临床感染，但是在脾脏边缘区域的淋巴滤泡中检测到了病毒的非结构蛋白(Nsp3)和病毒核酸，进一步证实脾脏树突状细胞(DC)是SADS-CoV在小鼠中复制的主要部位，表明SADS-CoV具有感染啮齿类动物的能力。除各种动物细胞系外，SADS-CoV还能够在体外感染多种人类细胞系(Huh-7、HepG2、293T、A549和HeLa)，通过间接免疫荧光(IFA)在感染细胞中均检测到了SADS-CoV的M蛋白，尤其在Huh-7细胞中 M蛋白呈现高效表达；利用qRT-PCR技术在感染细胞中检测到较高水平的SADS-CoV病毒RNA，特别是在Huh-7、293T以及HeLa细胞中病毒RNA含量较高，以上结果表明SADS-CoV能够在上述几种人类细胞系中感染增殖[17]。

严重急性呼吸道综合症冠状病毒(severe acute respiratory syndrome coronavirus，SARS-CoV)和中东呼吸综合征冠状病毒(middle east respiratory syndrome coronavirus，SARS-CoV)对动物和公共卫生造成的危害尽人皆知，两种病毒被认为起源于蝙蝠，分别通过中间宿主果子狸和单峰骆驼传染给人类，并在世界范围内引发数千人丧生的大流行[32-33]。虽然目前还未有人感染SADS-CoV病毒的相关报道，但基于SADS-CoV能够在人细胞系中有效增殖的能力，不应该低估这种蝙蝠起源的冠状病毒可能从猪“跳跃传播”到人的风险[17]。

6 展望

SADS-CoV作为一种新发现的猪肠道冠状病毒，对这种蝙蝠起源的冠状病毒了解还不够深入全面，如病毒的理化特性、致病机理、病毒的编码蛋白功能等方面，以及对该病的防控方面还没有很好的对策。虽然在病毒的起源、致病性、诊断方法和检测技术等方面有了一定进展，但是对SADS-CoV的研究还不够深入和系统，仍然存在许多尚未解决的问题。

迄今为止，仍然没有发现SADS-CoV病毒可利用的细胞受体，已知的冠状病毒宿主细胞受体包括有血管紧张素转换酶2(ACE2)、二肽基肽酶4(DPP4)以及氨基肽酶N(APN)，然而这些功能蛋白受体均不能作为SADS-CoV病毒进入细胞的受体[3]。所以，SADS-CoV细胞受体有待进一步深入研究发现，细胞受体的鉴定可以为防控SADS提供新思路，一方面，通过研究鉴定SADS-CoV进入细胞结合受体的关键位点，阻断病毒的结合区域，研制相应的细胞受体阻断剂，开发抗病毒药物；另一方面，可以研究SADS-CoV与宿主细胞受体的相互作用以及病毒的感染机制。很多冠状病毒辅助蛋白在免疫调节和病毒发病机理中起着重要作用[34]，目前有关SADS-CoV病毒基因组编码的蛋白及其功能还不够清楚，基本都是依据其他冠状病毒编码蛋白的功能进行推测，尤其是一些辅助蛋白的功能有待深入研究。SADS-CoV与其他猪肠道冠状病毒感染小肠组织后引起的腹泻症状相似，但其具有非常广泛的组织嗜性，除了肠道组织外在其他组织脏器中也有分布，表明病毒的感染和致病机制更加复杂，需要进一步深入研究。

目前，防控本病的主要措施就是控制传染源和切断潜在的传播途径。然而，SADS-CoV从蝙蝠到猪的传播机制还不清楚，YANG等[17]提供了新的启示，除蝙蝠和猪以外，啮齿类动物还可能成为SADS-CoV的易感宿主。在中国这种封闭式的养殖环境条件下，养殖场的猪群与飞行的蝙蝠直接接触的可能性很小。但是，在养猪业中经常见到啮齿动物(尤其是老鼠)，当蝙蝠在养猪场附近捕食昆虫时，可能会留下含有蝙蝠HKU2冠状病毒的粪便，而附近野鼠密切接触这些粪便后可能会成为感染带毒者，并在啃咬饲料的过程中其排泄物污染猪饲料，然后被猪食用后，随后成为SADS-CoV的携带者。所以，今后很有必要对养猪场附近的野鼠进行SADS-CoV的检测，以探究SADS-CoV潜在的中间宿主，切断鼠传播的可能性，以期更好地防控SADS疫情。研究发现，SADS-CoV起源于中华菊头蝠冠状病毒HUK2，中华菊头蝠作为一种中型蝙蝠，常栖息于洞穴、废弃的窑洞以及枯井中，在国内的分布也较广泛，主要集中在我国西南以及东南地区，包括云南、四川、重庆、西藏、陕西、安徽、浙江、江苏、湖北、江西、广东、广西和福建等地[35]。由于蝙蝠是唯一具有飞行能力的哺乳动物，与陆上哺乳动物相比具有更长的迁徙范围[36]，这对SADS-CoV的防控难度大大增加。目前，SADS疫情主要在广东省暴发蔓延，福建地区也有相关报道，其他地区虽然暂时无相关报道，但绝不能掉以轻心。尤其在中国南方地区因其独特的亚热带气候，高密度的养殖环境以及蝙蝠的广泛分布，促进了蝙蝠源冠状病毒的跨物种传播的可能性。相关记录表明这是蝙蝠源冠状病毒首次跨物种传播到家畜[37]，而引发猪群大规模致死性腹泻。所以，上述这些地区应加强对中华菊头蝠中SADS-CoV相关冠状病毒的携带情况进行实时监测、发现、鉴定。这对于防控SADS疫情的再次暴发、保障养猪业生产安全意义重大。

截止目前，对于该病尚无有效的治疗方法，疫苗接种一直是预防和控制传染病的有效措施，然而目前尚无SADS-CoV的相关疫苗问世，鉴于该病对新生哺乳仔猪造成的严重危害性，今后随着对病毒致病机制的深入研究，希望能够加强对SADS-CoV疫苗的研发，为将来SADS的防控提供有效治疗手段。