致奶牛乳房炎大肠杆菌免疫生物学特性

严 勇，李新圃，丁学智，严作廷，王胜义，武小虎，李宏胜，王旭荣 (中国农业科学院 兰州畜牧与兽药研究所 农业部兽用药物创制重点实验室/甘肃省新兽药工程重点实验室，甘肃 兰州 730050)

奶牛乳房炎是奶牛常见的三大疾病之一，不仅能导致乳产量和质量的下降，还会增加治疗费用，严重的还会造成奶牛淘汰和死亡，给奶牛养殖业造成巨大的经济损失[1-2]。随着我国奶牛集约化养殖模式的推广及对奶牛乳房炎防控水平不断的提高，乳房炎致病菌种类和菌群发生了变化，环境性病原菌，尤其是大肠杆菌的检出率呈逐年升高趋势[3]。大肠杆菌一般造成奶牛全身性的急性临床型乳房炎，在分娩前后和泌乳早期较易感染，即使治愈后大肠杆菌被完全清除，对乳腺组织造成的损伤仍需要很长时间才能恢复，使乳产量和质量很难恢复到发病前的正常水平[4]。牛场粪便中滋生的大肠杆菌，是引起奶牛乳房炎的主要传染源，因此，加强环境卫生是控制大肠杆菌性奶牛乳房炎发生的有效措施。近年来，在治疗中由于抗生素的大量使用及不规范滥用，造成大肠杆菌耐药性呈逐年增多趋势，而且多重耐药性严重，给大肠杆菌性乳房炎的治疗带来困难[5-6]。为了有效防控大肠杆菌性奶牛乳房炎，国内外学者开展了长期广泛的研究，但由于乳房炎大肠杆菌致病及耐药机理复杂，血清型繁多，不同地区及牛场优势血清型又不一样，给治疗药物及疫苗研究带来巨大的挑战。本研究对乳房炎大肠杆菌的致病性、致病因子、血清型、耐药性、耐药机制及防控策略进行综述，以期为今后更好的防控大肠杆菌性奶牛乳房炎提供参考。

1 奶牛乳房炎大肠杆菌的致病性研究

大肠杆菌是引起奶牛乳房炎常见的病原体之一，通常引起奶牛全身性急性临床型乳房炎。大肠杆菌性乳房炎在奶牛分娩前后和泌乳早期的发病率较高，临床症状变化范围很大，从明显的局部乳房症状到严重的全身性临床反应，严重影响高产奶牛的生产力[7]。近年来，随着奶牛集约化养殖模式推广，规范化挤奶程序、干奶期治疗和现代化管理方式的应用，传染性乳房炎病原菌的检出率有所下降，而环境性乳房炎病原菌，特别是大肠杆菌的检出率呈现增多趋势[3]。RIEKERIN等[8]对加拿大10省份106个奶牛场采集的3 033份乳房炎奶样进行细菌分离鉴定，结果大肠杆菌的检出率占到整个检出病原菌的第2位，高达17.6%。涂军[9]采集广西南宁地区临床型乳房炎奶样156份，采用生化鉴定方法进行了细菌分离鉴定、检出6种156株病原菌，其中大肠杆菌检出率最高，高达46.8%(73/156)。GAO等[10]对从甘肃、内蒙古、黑龙江、广西以及中国东部地区共161个大型奶牛场采集的3 288份临床性乳房炎牛奶样本进行细菌分离鉴定，结果大肠杆菌检出率最高(检出473株)，占病原菌总数的14.4%。张莉莉[11]对甘肃、宁夏、青海和内蒙古的12个奶牛场采集的202份奶牛乳房炎牛奶样本，采用16S rDNA测序方法进行了细菌分离鉴定，结果鉴定出3种病原菌，其中大肠杆菌检出率最高(34.4%)。李丽好[12]对河北地区采集的159份奶牛乳房炎奶样进行细菌分离、采用生化和PCR鉴定方法，鉴定出3种96株病原菌，其中大肠杆菌17株，检出率为17.7%。大量研究显示，奶牛大肠杆菌性乳房炎发病率的高低与牛场环境卫生的好坏及管理水平有直接的关系，因此，为了降低大肠杆菌性奶牛乳房炎发病率，应加强环境卫生管理，尤其是在梅雨季节要及时清理运动场粪便，定期对运动场用烧碱及消毒液进行消毒，减少环境病原菌滋生。

2 奶牛乳房炎大肠杆菌致病因子研究

大肠杆菌的致病力跟其携带的毒力因子相关，肠道外致病性大肠杆菌的致病因子主要包括Ⅰ型菌毛、脂多糖(LPS)和铁摄取等。

2.1 Ⅰ型菌毛Ⅰ型菌毛是肠杆菌中最常见的黏附因子，呈管状螺旋结构，由主要结构亚基FimA和次要结构亚基FimF、FimG、FimH蛋白构成。从结构上看FimG和FimF亚基将FimH与FimA连接，连接顺序依次为FimA-FimF-FimG-GimH。Ⅰ型菌毛能够结合多种真核细胞，主要是由于FimH能识别甘露糖受体，FimH还能促进黏附、内化和形成胞内聚合物的作用。Ⅰ型菌毛能够黏附非物体表面，这对生物被膜的形成有促进作用，使大肠杆菌在外界环境中更具有选择优势。

2.2 LPSLPS是大肠杆菌特有的成分，由类脂A、核心多糖、O抗原组成。LPS在细菌增值或裂解过程中释放出来，引起宿主炎症反应，大肠杆菌性奶牛乳房炎所表现出来的临床症状部分原因主要是由于LPS的致病作用。O抗原是大肠杆菌血清型分型的依据，类脂A是LPS的生物活性成分，当在细菌表面暴露时，由巨噬细胞介导，表现出免疫原性。LPS诱导奶牛乳房炎的炎症反应，引起中性粒细胞迁移。类脂A引起乳房炎的全身症状，如发热、脱水、减少泌乳量和减缓瘤胃蠕动等。

2.3 铁摄取铁是细胞新陈代谢和生长发育所必需的元素，宿主体内铁离子大多数都是与循环蛋白结合，如转铁蛋白、血红素和乳铁蛋白等。大肠杆菌摄取铁的机制有两种，即产生溶血素和生成铁结合性复合物，其致病性的强弱与从宿主摄取铁的能力直接相关。

通常根据毒力因子与致病过程，将对人和动物有致病性的大肠杆菌分为不同的致病类型。有人提出，将引起奶牛乳房炎的大肠杆菌作为一种新的致病类型，但大肠杆菌的毒力因子对奶牛乳房炎和临床严重程度的影响尚未完全阐明。自20世纪70年代，人们一直研究致病性大肠杆菌对奶牛乳房炎的影响。研究显示，从复发性奶牛乳房炎中分离的大肠杆菌表现更强的致病性和侵袭力。引起奶牛乳房炎的大肠杆菌比共生菌繁殖速度更快，抗中性粒细胞吞噬的能力更强[13]。BURVENICH等[14]研究结果显示，牛源大肠杆菌引起的奶牛乳房炎的严重程度，主要取决于奶牛自身抵抗力，而不是大肠杆菌的致病性。KEMPF等[15]对引起奶牛乳房炎的大肠杆菌基因组与其他动物致病性大肠杆菌进行比较，结果显示，引起奶牛乳房炎大肠杆菌携带的毒力基因很少，缺乏目前发现的真正毒力基因。LEIMBACH等[16]对奶牛乳房炎分离的大肠杆菌和健康奶牛粪便中分离的共生大肠杆菌进行基因组学分析，同样也显示，引起奶牛乳房炎大肠杆菌没有特殊的致病因子。

3 奶牛乳房炎大肠杆菌的血清型研究

奶牛乳房炎大肠杆菌和其他动物源大肠杆菌一样血清型非常复杂，O抗原有196种，K抗原有80种，H抗原有56种，基于O、H和K抗原已经识别超过700种血清型，但致病性大肠杆菌的血清型数量仅占少数。传统的大肠杆菌血清型鉴定方法主要是用家兔制备的高免因子血清进行免疫扩散或乳胶凝集试验，由于商品化的分型血清制备时间长达几个月，价格昂贵，有些O抗原血清会遇到菌体发生自凝或粗糙型无法分型等情况，同时有些分型血清还因为效价低、血清交叉反应等影响，造成有些菌株鉴定错误或无法鉴定等问题[3]。因此，科研人员为了提高分型检测的准确度，创建了基于基因wzx/wzy、wzm/wzt特异性DNA片段或rfb基因簇差异区域DNA序列设计特异性引物进行PCR血清分型鉴定的方法，大大提高了大肠杆菌的分型鉴定准确率。王娟芳等[17]建立了同时检测致病性大肠杆菌O1、O2和O78血清型的三重PCR检测方法，对146株大肠杆菌血清型进行检测，结果特异性良好，准确率为99.32%。

杨彩霞等[18]对从辽宁地区16家奶牛场采集的151份临床型乳房炎奶样中分离鉴定出的84株大肠杆菌，进行血清型研究，结果59株为O抗原血清型，优势血清型为O51、O60、O148、O21等10个血清型，25株未能鉴定出血清型。黄龙[19]对从宁夏地区采集的临床型乳房炎奶样中分离出的120株大肠杆菌，进行O抗原血清型鉴定，结果71株鉴定出21种血清型，优势血清型是O158、O126、O101、O91等7种，还有49株未能鉴定出血清型。MAHMOUD等[20]对伊朗地区患临床乳房炎乳样中分离出的大肠杆菌进行血清型鉴定，优势血清型为O55、O111、O124。

从以上研究结果可以看出，引起奶牛乳房炎的大肠杆菌血清型众多，不同地区及不同奶牛场由于气候及管理因素不一样，大肠杆菌优势血清型均不同，这为研制有效的奶牛乳房炎大肠杆菌疫苗造成了困难。由于大肠杆菌的致病性与血清型有关，因此，对奶牛乳房炎大肠杆菌进行血清型研究，是今后有效预防和治疗大肠杆菌性奶牛乳房炎的重要措施。

4 奶牛乳房炎大肠杆菌耐药性研究

由于抗生素不规范的滥用，奶牛乳房炎大肠杆菌的耐药性呈现逐年增加趋势，而且多重耐药形势严峻。大肠杆菌是2017年世界卫生组织(WHO)发布的全球重要耐药细菌之一。TOMAZI等[21]对从巴西东南部20个奶牛场2 637头患临床乳房炎的奶牛采集的4 212份奶样分离鉴定出的276株大肠杆菌，进行药敏试验，结果显示，70%的大肠杆菌对红霉素、青霉素、苯唑西林等常用抗生素耐药。姚伟等[22]对从辽宁地区某奶牛场采集的75头患临床型乳腺炎的奶样中分离鉴定出的44株大肠杆菌，进行药敏试验，结果显示，超过85%的菌株对磺胺类药物高度耐药，30%的菌株对氯霉素类药物耐药。张金宝等[23]对从宁夏地区部分奶牛场患奶牛乳房炎的奶样中分离鉴定出的197株大肠杆菌进行药敏试验，结果显示，氨苄西林耐药率最高达68.48%，其次是多西环素、四环素和链霉素耐药率达39%，而且多重耐药非常严重。由于不同地区引起奶牛乳房炎的大肠杆菌对同一药物的耐药性存在很大差异，这可能与不同奶牛场使用抗生素种类不同及治疗规范程度不一有关。由于大肠杆菌是人畜共患病原菌，其表现出来的高度耐药和多重耐药性，严重影响食品卫生及公共卫生安全。因此，长期开展和监测奶牛乳房炎大肠杆菌耐药性是有效预防和治疗大肠杆菌性奶牛乳房炎，保障人类食品安全的一个重要措施。

5 奶牛乳房炎大肠杆菌耐药机制研究

大肠杆菌属于革兰阴性杆菌，由于其外膜结构的特殊性，导致其对许多抗生素具有天然耐药性。除了天然耐药性，细菌还能通过基因突变或基因的水平转移获得耐药性。牛源大肠杆菌的耐药机制，主要分为3类：降低膜的通透性和外排泵过量表达，使胞内抗生素达不到最小抑菌浓度；抗生素作用的靶位点改变；产生灭活酶或钝化酶。

5.1 降低膜的通透性和外排泵过量表达大肠杆菌独特的外膜结构使许多抗生素无法到达胞内，从而产生耐药性。研究显示，亲水性抗生素可以通过大肠杆菌无特异性的外膜蛋白OmpF和OmpC进入胞内，但耐药菌株通过减少外膜蛋白的表达量降低外膜的通透性或用特异性更好的通道替代孔蛋白，使进入胞内的抗生素减少，达不到最小抑菌浓度，从而对抗生素产生耐药性[24-25]。同时还发现，在肠杆菌中，孔蛋白表达量的减少能对碳青霉烯类和头孢菌素类同样产生耐药性[26]。

外排泵是大肠杆菌对许多抗生素耐药的主要原因，当外排泵过量表达时，进入菌体内的抗生素被排出，使药物浓度处于低水平，对常用抗生素产生高度耐药性。新的多药外排泵不断被发现，如变异链球的MdeA，肺炎克伯雷杆菌的KexD和金黄色葡萄球菌的LmrS[27-28]。对大肠杆菌RND家族的AcrAB-TolC外排泵研究较多，是由三聚体内膜蛋白AcrB、周质融合蛋白AcrA和外膜通道蛋白TolC组成[29]。研究显示，AcrB有远端和近端2个结合位点，可以结合不同种类的抗生素，从而产生多药耐药性[30]。虽然大肠杆菌染色体上都携带有编码多药外排泵的基因，但仍在质粒上检测到多药外排泵的基因。

5.2 抗生素作用的靶位点改变通常抗生素与靶位点特异性结合才能发挥抑菌作用，若靶位点结构改变，会降低抗生素与靶位点的亲和力，从而使细菌产生对抗生素的耐药性。大肠杆菌可以通过单个基因位点突变或镶嵌基因修饰靶蛋白，从而产生对抗生素的耐药性。研究显示，大肠杆菌编码的DNA回旋酶(gyrA、gyrB和拓扑异构酶)的parC和parE基因发生突变，使DNA回旋酶和拓扑异构酶结构发生改变，导致喹诺酮类抗生素与菌体结合靶位点的亲和力降低，从而使大肠杆菌对喹诺酮类药物产生了耐药[31]。此外，大肠杆菌还可以对靶蛋白进行保护性修饰，从而产生耐药性。红霉素核糖体甲基化酶(erm)和耐氯霉素-氟苯尼考(cfr)耐药基因通过质粒广泛传播[32]。erm可使16S rRNA甲基化，从而使大肠杆菌对大环内酯类、林可酰胺类和链霉素类产生耐药性[33]。cfr的甲基转移酶能特异性地修饰23S rRNA的A2503，从而使大肠杆菌对氯霉素、链霉素类和恶唑烷酮类等抗生素产生广泛的耐药性[34]。另外，armA和rmt基因编码的甲基转移酶可使16S rRNA甲基化，使大肠杆菌对氨基糖苷类药物产生高度耐药。

5.3 产生灭活酶或钝化酶大肠杆菌产生直接对抗生素进行水解或修饰的钝化酶是对抗生素产生耐药性的主要机制。有很多钝化酶已经被发现，能对β-内酰胺类、氨基糖苷类、氯霉素类和大环内酯类抗生素进行水解或修饰。人们发现各种β-内酰胺类钝化酶都能水解β-内酰胺类抗生素，形成交叉耐药。有些钝化酶的抗菌谱已经扩大，如早期的β-内酰胺酶只能水解第1代β-内酰胺类抗生素，现在ESBLs能水解氧化头孢烯类抗生素[35]。从对β-内酰胺类抗生素耐药菌中已经分离出各种ESBLs和碳青霉烯酶的耐药基因，如在革兰阴性大肠杆菌中发现的IMP、VIM、KPC、OXA和NDM钝化酶。ESBLs的耐药基因主要由CTX-M家族基因编码，其中CTX-M14和CTX-M15酶检出率最高[36]。由kpc和ndm基因编码的碳青霉烯酶包括β-内酰胺酶A、B和D，能对碳青霉烯类和广谱头孢菌素类抗生素产生耐药，这些耐药基因通过染色体和质粒在细菌中广泛传播[37]。

对抗生素的化学基团进行修饰，阻碍抗生素与靶位点结合，从而对抗生素产生高度耐药性。氨基糖苷类抗生素有许多羟基和氨基暴露出来，易被乙酰转移酶、磷酸转移酶和核酸转移酶进行化学基团修饰。还有利福平磷酸转移酶，它的耐药基因在致病菌中广泛存在[38]。

综上所述，奶牛乳房炎大肠杆菌的耐药机制错综复杂，通过质粒上耐药基因转移获得耐药性，是细菌耐药性检出率升高和产生多重耐药的主要原因。因此，单纯开发新药永远赶不上大肠杆菌产生耐药性的速度。因此，探明奶牛乳房炎大肠杆菌的耐药机制非常重要，未来研究消除大肠杆菌耐药性的抑制剂及减少耐药的方法，将为现有药物的新用及协同用药提供科学依据。

6 奶牛乳房炎大肠杆菌的防控策略

挤奶前后消毒对奶牛乳头消毒措施的实施和干奶期治疗，使传染性乳房炎得到很好的控制。但这些措施治疗大肠杆菌性乳房炎的效果不明显，大肠杆菌的防控更依赖于减少环境中致病性大肠杆菌的数量、提高营养水平或接种疫苗提高机体的免疫力。

6.1 防控奶牛乳房炎大肠杆菌的疫苗研究由于奶牛乳房炎大肠杆菌耐药性越来越严重的趋势，研究大肠杆菌疫苗显得极为重要。目前奶牛乳房炎大肠杆菌疫苗研究，最成功的是美国的J5疫苗，该疫苗选用的是1株拥有不完全O多糖的突变株，也就是突变株的脂多糖核心区和脂A区抗原是裸露的，这样就使裸露的核心抗原可以刺激机体产生抗原，从而提高乳中和血清中抗大肠杆菌抗原的抗体效价。临床使用结果显示，奶牛肩胛部接种J5疫苗后，血清中IgG1和IgG2抗体水平显著高于对照组，可减少因肠杆菌感染引起的乳房炎发病率，降低奶产量损失和淘汰率。此疫苗目前已经商业化，在全世界多个国家得到广泛应用[39]。候书宝[40]构建可表达脂多糖蛋白的奶牛乳房炎大肠杆菌lps基因工程亚单位疫苗，小鼠免疫脂多糖蛋白疫苗后特异性抗体和免疫活性细胞因子表达水平与对照组比较明显提高，可显著提高血清中IL-2、IL-4和IFN-γ水平，免疫小鼠用野生强毒株大肠杆菌攻毒后，脂多糖蛋白疫苗组的保护率达60%～70%，明显高于质粒免疫组(20%)和对照组(0%)。增强宿主对病原菌的免疫力是防控致奶牛乳房炎大肠杆菌的有效措施。有报道牛免疫大肠杆菌疫苗后可减少大肠杆菌O157在牛群和人群中的流行，还可以减少奶牛乳房炎发病造成的损失[41]。目前，致病性大肠杆菌疫苗在人、鸡、猪有较多的研究。预防奶牛乳房炎大肠杆菌的商品化疫苗较少，大部分处于实验室阶段，借助基因组学和蛋白组学分析技术，有望加快疫苗研发速度和进程。

6.2 防控大肠杆菌性乳房炎的营养管理长久以来，营养管理在乳房炎发病中的作用很难跟其他影响因素区分开，所以一直存在争议。直到有研究证明饲料中缺乏维生素E和硒会增加临床乳房炎的发病率和感染时间，后续研究证明，硒在维持中性粒细胞功能具有重要作用，缺硒的牛群亚临床和临床乳房炎的发病率增加。乳房免疫系统的激活需要微量元素铜、钴、锰和维生素A、C、E等，哺乳期奶牛应在日粮中添加这些微量元素来提高乳房免疫力，增加清除大肠杆菌的能力[42]。

6.3 防控奶牛乳房炎大肠杆菌管理措施经过几十年的研究，人们认识到，防控乳房炎的基础是防止健康奶牛发生感染，并缩短奶牛持续感染时间。严格挤奶措施的实施和抗生素的使用，使传染性乳房炎得到了有效的控制，但这些措施对大肠杆菌无明显效果。致奶牛乳房炎大肠杆菌的防控主要取决于减少乳头接触病原体，增加奶牛对感染的抵抗力。大肠杆菌属于环境病原菌，其导致的乳房炎的主要原因是环境管理不当，如卧床潮湿、牛舍环境差和蚊蝇乱飞等，因此必须重视环境卫生的消毒，尤其运动场泥泞或梅雨季节更应重视综合防控，减少环境中乳房炎病原菌的载量。有机垫料能为大肠杆菌和环境链球菌提供充足营养，细颗粒有机垫料更易黏附在乳头表面，增加乳头暴露病原体的风险，所以定期进行垫料的更换或使用无机垫料减少病原菌的滋生[42]。还有保持奶牛乳房卫生、在挤奶前后对挤奶工的双手和挤奶机进行消毒、挤奶后对乳头进行药浴、干奶期使用长效抗生素进行乳房灌注治疗和扑杀长期感染的奶牛等措施。每季度使用诊断试剂对牛群进行乳房炎筛查，根据实验室药敏试验结果进行抗生素治疗和综合防控措施的改进，争取做到早发现、早治疗，防止向临床乳房炎发展。

7 前景与展望

本研究团队长期对我国奶牛场开展乳房炎病原菌区系分布及抗生素耐药性监测研究，结果发现，大肠杆菌的检出率与环境卫生和管理因素有非常大的关系，大肠杆菌产生耐药性的原因与牛场长期使用一种抗生素及不规范滥用有关，因此，为了降低大肠杆菌性乳房炎发病率，提高治疗效果，对奶牛场加强卫生管理及定期环境消毒显得极为重要，其次在用药方面进行治疗前病原菌抗生素敏感性检测，用药要搭配使用，疗程要足够是取得良好治疗效果的关键。目前，由于越来越严重的牛源大肠杆菌耐药性的出现，使奶牛乳房炎的治疗效果不断下降，因此，加强大肠杆菌耐药机制的研究刻不容缓。由于奶牛乳房炎大肠杆菌是人畜共患病原菌，其耐药性可通过质粒基因转移获得，因此，长期开展和监测奶牛乳房炎大肠杆菌耐药性是有效预防和治疗大肠杆菌性奶牛乳房炎，保障人类健康及食品卫生的一个重要措施。研究消除大肠杆菌耐药性的机制及降低耐药性的抗生素增效剂，将为现有药物的新用及协同用药提供科学依据。由于牛源大肠杆菌血清型复杂，免疫机制多样，给疫苗研究带来困难。本研究团队发现奶牛乳房炎灭活大肠杆菌疫苗免疫效果不佳的原因与疫苗菌株血清型与发病牛场大肠杆菌血清型不一致有关，其次是灭活苗只能诱导机体产生体液免疫，最终导致免疫效果不佳。未来新技术的使用对新型大肠杆菌疫苗的研制将起到推动性的作用，例如各类亚单位疫苗、载体疫苗和核酸疫苗的兴起将带来新的希望，它们不仅具有更高的免疫原性，更安全和稳定。未来，利用基因重组、基因缺失和反向编辑技术研制新型大肠杆菌疫苗效果会更加期待。