MicroRNA调控卵巢颗粒细胞功能的研究进展

何晓，沈豪飞，姚莹，张学红

卵巢颗粒细胞在卵泡形成窦腔时，分化为卵丘细胞(cumulus cells,CC)和壁层颗粒细胞(mural granulosa cells,MGC)。CC突起的尖端穿过透明带，终止于卵母细胞膜,从而形成卵丘-卵母细胞复合体。CC通过缝隙连接与卵母细胞进行双向信息传递，进而有助于卵母细胞的成熟、受精与早期胚胎发育[1]。MGC表面存在多种受体，并且能够分泌多种激素和细胞因子，以自分泌和旁分泌的方式调节卵泡生长发育和成熟[2]。研究表明，在卵母颗粒细胞复合物中加入颗粒细胞可改善卵母细胞的代谢，有助于其在体外生长[3]。还有其他实验支持颗粒细胞质量的下降和凋亡的增多会影响卵母细胞质量以及受精率和妊娠率[4]。由此可见，对颗粒细胞功能的研究很必要。MicroRNA(miRNA)是一类高度保守的小型非编码RNA，大小一般为18～24个核苷酸，通过互补结合其靶基因的3′非翻译区(3′UTR)，从而参与转录后水平的基因调控，调节细胞的增殖、分化、凋亡、肿瘤形成等生物学过程。目前在生殖领域中，对其研究主要集中在以下三个方面：① miRNA调节卵母细胞发育和成熟的方式[5]。② miRNA在卵母细胞和颗粒细胞双向通信过程中的作用[1]。③ miRNA在子宫内膜异位症等生殖疾病中的作用[6]。在查阅大量文献后发现，之前研究大多停留在miRNA在卵巢颗粒细胞不同阶段中的差异性表达，以及对细胞功能的影响，但具体调控机制和下游因子改变的认识较浅，因此本文就近年来miRNA在颗粒细胞凋亡、增殖和类固醇激素合成中的作用和调控机制予以综述。

1 miRNA对颗粒细胞凋亡的调控

凋亡是一种程序性的细胞死亡，半胱天冬酶(caspase)又称凋亡蛋白酶，凋亡相关因子通过caspase级联反应诱导DNA片段化，导致细胞凋亡。颗粒细胞凋亡是卵泡闭锁的主要原因之一，而闭锁是卵泡生长发育和维持的重要环节。卵巢早衰(premature ovarian failure,POF)指40岁之前因卵巢功能衰竭所致的闭经，伴随血促性腺激素过多和雌激素过少，颗粒细胞凋亡在POF发病机制中发挥重要作用，通过研究卵巢颗粒细胞凋亡的调控机制可对POF的诊疗提供帮助。

1.1 促进颗粒细胞凋亡的miRNA

Zhou等[7]发现miR-150促进绵羊卵巢颗粒细胞的凋亡，在体外过表达miR-150增加促凋亡因子Bax和caspase3的表达，减少类固醇生成性急性调节蛋白的表达，与黄体期颗粒细胞相比miR-150在卵泡期颗粒细胞中的表达增加，这与黄体期颗粒细胞凋亡增多引起卵泡闭锁相吻合。此现象引导研究者们继续探索miRNA对颗粒细胞凋亡的影响。过氧化物酶体增殖活化受体γ辅助活化因子1α(peroxisome proliferator-activated receptor gamma coactivator-1 alpha,PPARGC1A)是线粒体合成的关键因子，其可通过多种途径减轻氧自由基损伤、抑制炎症反应、抑制凋亡。过氧化氢处理后的山羊颗粒细胞凋亡，miR-1197-3p表达显著上升而PPARGC1A表达显著下降，miR-1197-3p抑制剂可减轻过氧化氢对细胞的凋亡并增加PPARGC1A的表达。miR-1197-3p可能通过线粒体依赖性细胞凋亡途径靶向PPARGC1A调控细胞凋亡[8]。另有研究发现miR-31和miR-143通过抑制卵泡刺激素(follicle stimulating hormone,FSH)受体的miRNA和蛋白质表达促进牛颗粒细胞的凋亡，此外过表达miR-31减少孕酮的合成，过表达miR-143同时减少孕酮和雌激素的合成，miR-31和miR-143的抑制剂对激素水平起反作用[9]。在基因转录过程中转录因子发挥重要的调控作用，类固醇生成因子1(steroidogenic factor 1,SF1)通过结合编码miR-202-5p基因附近启动子区域，激活转化生长因子βII型受体(transforming growth factor receptor 2,TGFβR2)，在mRNA和蛋白质水平上降解TGFβR2减弱TGFβ/Smad信号通路传导，从而诱导山羊颗粒细胞凋亡并抑制细胞增殖[10]。卵泡闭锁是卵泡发育、成熟和正常排卵中重要的生理过程，卵泡闭锁的加快导致POF患者异常排卵或不排卵，在收集临床标本后，Chen等[11]发现miR146a在POF患者血浆和卵巢颗粒细胞表达显著高于正常女性，进一步研究发现miR146a同时靶向白介素1受体相关激酶和肿瘤坏死因子受体相关因子6促进颗粒细胞凋亡，此外，caspase抑制剂可减弱miR146a对卵巢颗粒细胞凋亡的影响。由此可推测miR146a通过调控颗粒细胞凋亡参与POF的发病，但能否作为POF的预测和诊断依据，尚需结合临床进行深入研究。由上可知，miRNA通过调控靶基因促进颗粒细胞凋亡，进而参与卵泡闭锁及POF发生发展等过程，或许miRNA能够作为POF等疾病的临床指标和治疗策略。

1.2 抑制颗粒细胞凋亡的miRNA

目前研究发现抑制颗粒细胞凋亡的miRNA相比促进颗粒细胞凋亡的miRNA较少，现总结目前研究最透彻的三种miRNA：miR-181b、miR-222、miR-21。

Smads家族在TGFβ信号通路中扮演重要角色，不同Smad对TGFβ信号通路有不同的影响。Smad7影响TGFβR1的稳定性并阻碍TGFβR1与Smad2/3的结合，最终破坏TGFβ信号通路，该通路异常会影响颗粒细胞功能和卵母细胞成熟。在猪卵泡闭锁过程中下调的miR-181b可直接作用于Smad7基因，抑制颗粒细胞凋亡[12]。miR-222直接靶向血小板凝血酶蛋白1(thrombospondin1,THBS1)的3′UTR，miR-222模拟物抑制THBS1的mRNA和蛋白质，并导致抗凋亡因子Bcl-2上调，促凋亡因子caspase3下调；miR-222抑制剂促进THBS1表达，减少Bcl-2表达，但对caspase3无明显影响。miR-222通过影响THBS1抑制猪颗粒细胞凋亡[13]。当发现miR-21可抑制颗粒细胞凋亡后，研究者在体外用miR-21转染的间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSC)与化学诱导的大鼠POF颗粒细胞共培养，可有效抑制颗粒细胞的凋亡，同时磷酸酶与张力蛋白同源物(phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome 10,PTEN)和程序性细胞死亡因子4(programmed cell death 4,PDCD4)表达下调。下调的磷酸化PTEN激活蛋白激酶B途径，诱导细胞生长和增殖，并抑制细胞凋亡。PDCD4通过脂多糖介导的信号通路诱导细胞凋亡，PDCD4的下调保护细胞免受DNA损伤所致的凋亡。体内实验将miR-21转染的MSC移植到大鼠双侧卵巢，结果表明大鼠卵巢重量和不同阶段卵泡数目增加，雌激素水平增加而FSH水平降低。这意味着过表达miR-21促进MSC对POF的修复作用，这对POF患者改善卵巢功能提供了新的诊疗思路[14]。

2 miRNA对颗粒细胞增殖的调控

颗粒细胞的增殖功能对于卵泡发育、成熟和闭锁至关重要。多囊卵巢综合征(polycystic ovary syndrome,PCOS)是常见的因排卵障碍引起的不孕类型，已观察到PCOS患者颗粒细胞的增殖率显著上升，通过总结颗粒细胞增殖与miRNA的关系，为PCOS的发病机制和诊疗提供帮助。

2.1 miRNA在正常颗粒细胞增殖中的作用

为证明miR-320在颗粒细胞增殖中的作用，Yin等[15]在体内和体外鼠颗粒细胞中过表达miR-320，均表现为颗粒细胞增殖受抑制，并且miR-383能够增强miR-320对颗粒细胞增殖的抑制作用。miR-10b通过靶向脑源性神经营养因子(brain-derived neurotropic factor,BDNF)抑制山羊颗粒细胞的增殖，BDNF具有促进细胞增殖的作用，进一步研究将miR-10b与BDNF联合治疗发现促进颗粒细胞的增殖，可见miR-10b的抑制作用可通过BDNF的重新加入而逆转[16]，可考虑使用靶基因制剂去改善miRNA对颗粒细胞增殖的抑制作用。miR-224可通过靶向Smad4抑制小鼠颗粒细胞的增殖和雌激素的释放，Liang等[17]在此基础从转录水平出发，发现p53和p65因子通过结合miRNA-22的宿主基因GABAA受体ε亚基启动子下调miR-224，上调靶基因，由此思考是否可反调控miRNA来治疗相关疾病。miR-181a通过靶向激活素受体IIA(activin receptor IIA,AcvrIIa)减少增殖细胞核抗原的积累抑制颗粒细胞增殖[18]。特别的是Yan等[19]研究发现miRNA-145通过靶向AcvrIb抑制小鼠颗粒细胞增殖，而Xu等[20]发现miR-145通过靶向Krüppel样因子4保护小鼠颗粒细胞免受氧化应激导致的凋亡，因此miR-145在小鼠颗粒细胞中的作用仍需要更多的研究去证实。

2.2 miRNA在多囊卵巢综合征患者颗粒细胞增殖中的作用

miR-93在PCOS患者中过表达，通过靶向细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂1A增强永生化人颗粒肿瘤细胞的增殖，但不能排除高胰岛素血症和高雄激素对miR-93的影响，此现象仅在PCOS患者中发现，因此miR-93对健康颗粒细胞是否有调节作用仍需更加全面的研究[21]。PCOS患者中上调的miRNA还有miR-3940-5p、miR-140、miR-129和miR-17-5p等[17,22-25]。相反，在PCOS患者中低表达的miR-145、miR-483和miR-483-5p分别通过靶向胰岛素受体底物1、胰岛素样生长因子1(insulin-like growth factor 1,IGF1)、IGF2抑制颗粒细胞增殖[26-28]。近期研究发现PCOS患者中低表达的miR-129和miR-17-5p，当过表达两者时可见颗粒细胞增殖增加凋亡减少[22-23]。这些结果提示miRNA可作为改善PCOS患者颗粒细胞功能的新型分子靶标。

3 miRNA对颗粒细胞类固醇激素合成的调控

MGC产生多种类固醇激素和生长因子，通过影响颗粒细胞增殖与凋亡以及卵泡液的形成影响卵泡生长发育[2]，最重要的类固醇激素有雌激素和孕激素，他们通过负反馈下丘脑垂体性腺轴调控卵巢功能，雌、孕激素也是主要的抗凋亡因子。我们通过研究miRNA对类固醇激素的调控不但可以间接解释颗粒细胞凋亡，还对调控卵泡生长发育提供理论支持。

芳香化酶(CYP19A1)是体内雌激素合成的限速酶，直接影响体内雌激素的水平。研究发现miR-378直接靶向猪卵丘细胞CYP19A1抑制雌激素合成，从而影响卵母细胞成熟[29]；miR-1275则是通过靶向肝受体同源蛋白1影响CYP19A1表达从而抑制猪颗粒细胞雌激素合成[30]；Zhang等[31]发现过表达miR-205抑制小鼠颗粒细胞雌激素释放并促进细胞凋亡，作用机制与miR-205靶向环磷酸腺苷反应原件结合蛋白1(cyclic adenosine monophosphate responsive element binding protein 1,CREB1)调控caspase和CYP19A1轴有关，CREB1上调可部分挽救miR-205所致的细胞凋亡和雌激素抑制；相反miR-132靶向CYP19A1负向调节剂神经元相关受体1促进小鼠颗粒细胞雌激素的合成[32]。miR-320通过转录因子E2F1和SF1两个靶基因抑制小鼠颗粒细胞雌激素产生，同时部分促进孕酮和睾丸激素产生[15]。Mohammed等[33]在人颗粒细胞中发现miR-96通过抑制叉头转录因子1促进颗粒细胞孕激素产生。由上可知，miRNA在颗粒细胞雌、孕激素合成过程中起重要的调控作用，而雌孕激素对卵母细胞发育和胚胎成功着床极为重要，在辅助生殖技术中，我们可考虑通过检测颗粒细胞中与激素合成相关的特异miRNA初步评估卵泡质量和子宫内膜情况。

4 结语与展望

以上，我们总结miRNA在颗粒细胞凋亡、增殖和类固醇激素合成中的作用，miRNA与靶基因的特异性结合，引起靶基因和/或下游通路因子miRNA和蛋白质水平变化，进而调控颗粒细胞功能。目前研究的卵巢颗粒细胞多数取材于动物，无法准确反映miRNA对人颗粒细胞功能的调控，但对解释两者间机制提供一定方向，以后仍需要更多以人颗粒细胞为模型的研究为临床试验奠定理论基础。在今后的研究我们应多分析探索miRNA的多元化特征，深究其在颗粒细胞中的复杂网络调控系统，另外物种差异性和组织特异性问题也不容忽视。人类对新事物的认识是一个从宏观到微观，再从微观到宏观的过程，研究miRNA对颗粒细胞的调控机制为以后宏观调节颗粒细胞功能奠定了分子基础。异常颗粒细胞miRNA的研究为相关疾病提供新的诊疗思路，miRNA合成剂与抑制剂以及相应靶基因类似药物也将有望成为治疗不孕症相关疾病的新方法。此外，在人类辅助生殖技术中，是否可将miRNA作为微创诊断生物标记物预测卵母细胞和胚胎质量，更需要我们进一步的探索。