酶解制备竹笋可溶性膳食纤维及其抗氧化活性研究

2021-04-22 06:25万仁口贺杨正李功景李红艳邓泽元
中国食品学报 2021年3期
关键词:竹笋清除率光度

万仁口,贺杨正,李功景,张 兵,李红艳,邓泽元

(南昌大学食品科学与技术国家重点实验室 南昌330047)

竹笋一般是指竹鞭或秆基上萌发分化而成的膨大的芽和幼嫩的茎[1-2],其种类繁多,分布广泛,主要盛产于热带、亚热带和温带地区。其肉质鲜嫩,甜脆爽口,具有很长的食用历史,是一种深受人们喜爱的纯天然绿色健康食品[3-4]。竹笋含有蛋白质、多糖、氨基酸、维生素、矿物质等营养物质,具有一定的营养作用[5-7]。特别是竹笋含有丰富的膳食纤维,在肠内可减少人体对脂肪的吸收,有润肠、加强胃肠蠕动、去积食、防便秘[8]等特性,因此具有预防结肠癌等肠道疾病的作用;长期摄食膳食纤维可以降低心血管疾病、糖尿病、肥胖和胃肠道疾病的风险[7,9]。竹笋含有甾醇如β-谷甾醇,是一种强生理活性物质,具有降血脂、抗肿瘤、防治心脏病和抑制白血病细胞生长等生理功能[1,10]。竹笋还含有黄酮类物质,它是植物的次级代谢产物,具有保护人体血管的功能[11]。竹笋是碱性食物,能中和人体代谢过程中留在体液中的酸性物质,提高人体的抗病能力。中医认为竹笋性甘、微寒,能清热去痰,对咳嗽、高血压、便秘、糖尿病等均具有一定疗效,被誉为“素食第一品”,具有一定药用价值和保健功效。

膳食纤维可以作为功能食品的原材料[12],根据水溶性的不同,分为可溶性膳食纤维(SDF)和不溶性膳食纤维(IDF)两种[13-14]。竹笋膳食纤维中SDF 的比例是影响其生理功能的主要因素,高品质的膳食纤维SDF 含量高,而通常天然纤维中SDF 的含量仅为3%~5%,严重限制了其在食品工业的运用[15]。为了获得高品质的高生物活性的膳食纤维,需对原料进行改性处理[16-17]。膳食纤维的改性技术主要有化学改性、生物改性及物理改性3 种[18-19]。酶解法是生物改性技术的一种,因其反应温和、污染物较少而使用较为广泛[20-21]。

本研究采用酶解法来制备竹笋可溶性膳食纤维,以纤维素酶为水解酶,通过单因素和正交试验优化酶解pH 值、酶解温度、酶添加量和酶解时间等工艺条件,同时考察竹笋膳食纤维乙醇提取液对DPPH 自由基清除率、ABTS+自由基清除率及铁还原能力的影响,为高附加值开发竹笋提供试验数据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

竹笋,江西广雅食品有限公司;纤维素酶,南宁庞博生物工程有限公司;胰酶、糖化酶、α-淀粉酶、DPPH,阿拉丁试剂有限公司;MES、TRIS,索莱宝生物科技有限公司;无水乙醇、无水甲醇,上海西陇化工股份有限公司。

1.2 仪器与设备

K9860 自动凯氏定氮仪,海能仪器器械有限公司;SX2 型马弗炉,上海新苗医疗器械制造有限公司;SXT-06 索氏提取器,上海洪记仪器设备有限公司;SHZ-A 水浴恒温振荡器,上海博讯实验有限公司医疗设备厂;酶标仪,美国博腾仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 竹笋的成分测定 水分含量按GB5009-2010 中的直接干燥法测定,蛋白质含量按GB5009.5-2016 中的自动凯氏定氮法测定,灰分含量按GB5009.4-2016 测定,粗脂肪含量按GB5009.6-2016 中的索氏提取法测定,膳食纤维含量按GB5009.88-2014 测定,总糖以及甾醇含量的测定分别采用苯酚硫酸法和有机溶剂提取法。

1.3.2 酶改性法制备竹笋可溶性膳食纤维

1.3.2.1 单因素试验 准确称取5 g 竹笋样品于500 mL 高脚烧杯中,加入0.05 mol/L MES-TRIS缓冲液200 mL,依次加入250 μL α-淀粉酶、500 μL 糖化酶以及0.225 g 胰酶于60 ℃恒温振荡水浴环境中分别反应30 min,以去除淀粉、脂质以及蛋白质[22-23]。而后添加纤维素酶于一定条件下(pH、酶解温度、酶添加量、酶解时间)继续酶解,测定竹笋SDF。

1.3.2.2 正交试验 根据单因素优化试验结果,选择上述4 个因素,以L9(34)正交表进行正交试验,以进一步优化酶解条件。

1.3.3 膳食纤维的抗氧化性

1.3.3.1 样品处理 称取一定质量的SDF、IDF 以及TDF 于50 mL 离心管中,并用50%乙醇定容至刻度以配成质量浓度为0.625~20 mg/mL 的混合液。将其置于60 ℃恒温水域摇床振荡4 h,而后于4 000 r/min 的转速下离心15 min,上清液即为乙醇提取液,分别记做SDFE,TDFE,IDFE。

1.3.3.2 DPPH 自由基的清除能力[24]分别在10 mL 的具塞试管中加入2 mL 质量浓度为0.065 mg/mL 的DPPH 溶液,再加2 mL 的SDFE,TDFE,IDFE溶液或Trolox(BHT)溶液,充分振摇混匀,在暗处静置30 min 后移取100 μL 反应液至96 孔板,在517 nm 下测定吸光度值。以2 mL 样品溶液加入2 mL 无水乙醇作为对照,以2 mL DPPH 溶液加入2 mL 溶剂作为空白,计算对DPPH 自由基的清除率。其对DPPH 自由基的清除能力按以下公式计算:

清除率(%)=[1-(Ai-Aj)/Ao]×100

式中:Ai——DPPH 溶液+样品溶液的吸光度值;Aj——样品溶液+无水乙醇的吸光度值;Ao——DPPH 溶液+无水乙醇的吸光度值。

1.3.3.3 ABTS+自由基清除能力[25]取5.0 mL 7 mmol/L 的ABTS+溶液,加入88.0 μL 140 mmol/L的K2S2O8,在室温下置于暗处反应12~16 h,形成ABTS+自由基储备液,而后用体积分数80%的甲醇稀释ABTS+自由基储备液备用。准确量取0.1 mL的SDFE,TDFE,IDFE溶液或Trolox(BHT)溶液,加入3.9 mL ABTS+溶液,混匀,在室温下反应6 min,于734 nm 处测定吸光度AE。同时吸取3.9 mL ABTS+溶液,加入0.1 mL 体积分数80%的甲醇溶液于734 nm 处测定吸光度AB。其对ABTS+自由基清除率按以下公式计算:

清除率(%)=[1-(AE-AK)/AB]×100

式中:AE——ABTS+溶液+样品溶液的吸光度值;AK——样品溶液+80%甲醇溶液的吸光度值;AB——ABTS+溶液+80%甲醇溶液的吸光度值。

1.3.3.4 铁还原能力(FRAP)测定[26]分别在10 mL 的具塞试管中移取SDFE,TDFE,IDFE溶液或Trolox (BHT)溶液100 μL,加入预热至37 ℃的FRAP 工作液1.8 mL,摇匀置37 ℃恒温水域反应30 min,反应后分别移取100 μL 反应液置96 孔板中,用酶标仪在593 nm 处测定其吸光度值,同时进行空白试验。

1.4 数据处理与统计分析

2 结果与分析

2.1 竹笋中的主要成分

竹笋中主要成分含量如表1所示。竹笋中的水分以及总糖含量是影响其老嫩程度、滋味口感的两个重要影响因素,总糖及水分含量越高,竹笋的口感越好,品质越佳[27-28]。由表可知,竹笋的水分含量为95.20%,高于小佛肚竹笋(90.90%)[29]、云南箭竹(93.43%)[28]等大多数竹笋;总糖含量为14.32%,含量较小佛肚竹笋(16.04%)低,略高于云南箭竹(11.80%),但远高于文献所报道的常见蔬菜(2.00%~5.40%)的含量。由此可见该竹笋的品质较高,鲜嫩、口感较好。蛋白质和粗脂肪含量分别为28.20%和4.31%,蛋白质的含量高而粗脂肪含量低,表明竹笋是一种含有丰富蛋白质,天然低脂、低热量的健康食物。竹笋中还含有甾醇(29.00 mg/100 g)。膳食纤维是竹笋的主要组成成分,总膳食纤维占干竹笋质量的70.06%,其中IDF为64.53%,SDF 为5.53%,IDF/SDF 为11.722,可溶性膳食纤维的含量较低。综上所述,竹笋是一种含有丰富蛋白质、膳食纤维以及其它生物活性物质且鲜嫩度高、口感好的食材。

表1 竹笋主要成分Table 1 The composition of bamboo shoots

2.2 酶改性工艺的选择

2.2.1 单因素试验

2.2.1.1 pH 值对SDF 含量的影响 以竹笋粉末为原料,纤维素酶作为水解酶,酶解温度为60℃,酶解时间为1 h,酶添加量为0.1%,pH 分别为3.0,3.5,4.0,4.5,5.0,5.5 时,测定不同pH 值下酶解竹笋粉末SDF 的含量,以确定纤维素酶最佳的酶解pH 值。

不同pH 值酶解获得可溶性膳食纤维的含量如图1所示,当pH 3.5 时含量最低,而后随着pH的不断上升,SDF 含量有显著的增加。pH 4.5 时达到最高,约为7.5%,之后随着溶液酸性减弱,SDF 的含量也相应降低。pH 通过影响纤维素酶的活性影响可溶性膳食纤维的含量,当pH 在4.5 左右时,纤维素酶活性最佳,酶解效果最好,所以选择提取液pH 4.5 做进一步试验。

2.2.1.2 酶解温度对SDF 含量的影响 酶解温度分别设定为30,40,50,60,70 ℃,酶解时间1 h,酶添加量为0.1%,pH 为4.5,通过测定SDF 含量来研究不同酶解温度对纤维素酶酶解竹笋反应的影响。

图1 不同酶解pH 值对竹笋SDF 含量的影响Fig.1 Effect of different pH values on SDF content

图2 不同酶解温度对竹笋SDF 含量的影响Fig.2 Effect of different enzymatic hydrolysis temperature on SDF content

由图2可见,随着酶解温度的升高,竹笋可溶性膳食纤维的含量也增加,直到温度为50 ℃时达到最高值8.4%,而后随着温度的升高,其含量快速下降。酶的活性变化是影响SDF 含量的主要因素,当温度较低时,酶的活性较弱,酶分解不溶性膳食纤维生产可溶性膳食纤维的效果较差,而后随着温度升高,酶活力不断提升,到50 ℃左右达到纤维素酶的最适温度,再升高温度,酶逐渐失活,从而使SDF 含量下降[20]。因此,选择纤维素酶的酶解温度为50 ℃。

2.2.1.3 酶添加量对SDF 含量的影响 酶的添加量用与底物质量百分比来衡量,酶用量选取0.1%,0.2%,0.5%,1%,2%,酶解温度为50 ℃,酶解时间为1 h,pH 为4.5,通过测定SDF 含量,研究不同酶添加量对纤维素酶酶解竹笋反应的影响。

由图3可见,随着酶添加量的增加,可溶性膳食纤维的含量先逐步增加而后趋于稳定。当酶添加量为0.5%及以上时,其SDF 含量在10%附近浮动。当加酶量较低时,不溶性膳食纤维被纤维素酶降解,其中的不溶性半纤维素可酶解为可溶性半纤维素甚至变成葡聚糖,有效提高了SDF 的含量;当加酶量在高水平时,所得到的SDF 进一步水解,生成分子质量更低且不能被乙醇沉淀的糖类物质,降低了SDF 的得率[6]。选择适量的加酶量可以维持IDF 和SDF 的水解平衡,使得SDF 的含量达到最大。因此,纤维素酶的添加量选择0.5%最为合理。

2.2.1.4 酶解时间对SDF 含量的影响 酶解时间分别取1,2,3,4,5 h,酶解温度设定为50 ℃,酶添加量0.5%,pH 为4.5,通过测定SDF 含量,研究不同酶解时间对纤维素酶酶解反应的影响。

不同酶解时间对可溶性膳食纤维含量的影响如图4所示,酶解时间为3 h 最佳,SDF 的含量最高可达10.8%。酶解时间短,则酶解不完全;酶解时间过长,SDF 会进一步降解而导致含量降低。因此,选择酶解时间为3 h。

2.2.2 正交试验 根据单因子试验结果,正交试验的设计为pH 值、酶解温度、酶添加量、酶解时间等4 个因素,每个因素3 个水平,见表2。

正交试验结果见表3,根据极差R 值可以看出,影响SDF 含量大小的因素排序为:D>C>B>A。酶解时间的影响最大,酶解pH 值的影响最小。根据各因素k 值和直观比较,最佳工艺条件为A3B1C3D3,即SDF 最佳的酶解工艺为:pH 值为5.0,酶解温度45 ℃,酶添加量0.7%,酶解时间3.5 h。

图3 不同酶添加量对SDF 含量的影响Fig.3 Effect of different enzyme additions on SDF content

图4 不同酶解时间对SDF 含量的影响Fig.4 Effect of different enzymatic hydrolysis time on SDF content

表2 正交试验因素水平表Table 2 Orthogonal experimental factor-level table

2.3 竹笋膳食纤维的抗氧化活性

2.3.1 DPPH 自由基的清除能力 DPPH·是一种能够在室温条件下保持稳定的有机自由基,当抗氧化剂或供氢体出现时,稳定的自由基变成DPPH-H[30]。不同纤维浓度提取液SDFE、TDFE、IDFE、BHT 和Trolox 的DPPH 自由基清除率如图5所示,在纤维质量浓度为0.625 mg/mL 时,BHT 和Trolox 抗氧化剂的DPPH·清除率为80%~90%,而SDFE、TDFE、IDFE三者DPPH 自由基的清除率分别为21%,7.0%和6.7%。随着纤维浓度的升高,两种抗氧化剂的清除率迅速趋于100%,表现出极强的抗氧化性。SDFE、TDFE、IDFE的清除能力随着浓度的升高呈明显上升趋势,在质量浓度为20 mg/mL 时,SDFE的DPPH·清除率可达75.77%,明显高于TDFE(16.9%)以及IDFE(14%),表明高纤维浓度SDFE对DPPH·有较强的清除能力,3 种膳食纤维乙醇提物在相同纤维浓度下的DPPH·清除能力大小顺序为SDFE>TDFE>IDFE。

表3 正交试验设计及其结果Table 3 Orthogonal experimental design and its results

2.3.2 ABTS+自由基清除能力 ABTS+自由基被广泛应用于样品的总抗氧化能力的测定,当样品中存在抗氧化成分时,反应体系颜色变浅,在734 nm 处吸光度降低,吸光度越低,表明所检测物质的总抗氧化能力越强[31]。图6结果显示,随竹笋纤维浓度的增加,SDFE、TDFE、IDFE清除ABTS+自由基能力逐渐增强,且呈一定正相关性,但其清除率明显低于BHT 和Trolox。在纤维质量浓度为20 mg/mL 时,SDFE、TDFE、IDFE的ABTS+清除率分别可达70.2%,30.0%和13.1%,在同等纤维浓度下,SDF 提取物的清除能力明显优于TDF 和IDF 的醇提取物,即ABTS+清除率能力大小规律为SDFE> TDFE> IDFE。

图5 不同纤维浓度乙醇提取液(SDFE、TDFE、IDFE)的DPPH 自由基清除率比较Fig.5 Comparison of DPPH· scavenging rate of ethanol extracts (SDFE,TDFE,IDFE)at different concentrations of dietary fiber

图6 不同纤维浓度乙醇提取液(SDFE、TDFE、IDFE)的ABTS+自由基清除率比较Fig.6 Comparison of ABTS+ scavenging rate of ethanol extracts (SDFE,TDFE,IDFE)at different concentrations of dietary fiber

2.3.3 铁还原能力测定 还原能力是衡量抗氧化物质能否高效提供电子的重要评价指标,还原能力强的样品是良好的电子供体,可以通过提供电子使自由基变为稳定的物质,以中断自由基的连锁反应。研究表明,抗氧化活性同还原力之间呈正相关关系,物质的吸光度越大,还原能力越强,其抗氧化能力也越高。由图7可知,SDFE、TDFE、IDFE、BHT 和Trolox 抗氧化剂等5 种物质的吸光度值均与其质量浓度呈正相关,随着浓度的升高还原能力也随之增强。在相同浓度时,BHT 和Trolox 的总还原能力明显优于SDFE、TDFE、IDFE的还原能力,SDFE的铁还原能力明显优于TDFE与IDFE,还原能力大小规律与DPPH·清除能力以及ABTS+清除能力一致。

2.3.4 抗氧化指标的线性分析 竹笋SDFE,TDFE以及IDFE对DPPH 自由基和ABTS+自由基均有一定的清除能力,并随质量的增加而增强,呈较强的线性关系,R2均在0.876~0.968 之间,但不同膳食纤维抗氧化指标的IC50差别较大。

在还原力试验中,吸光度值越高,表示还原能力越强。由表4可知,竹笋3 种膳食纤维提取物均具有一定的还原能力,并呈现出与其它两种抗氧化指标相似的规律,随着样品质量浓度的增加而增强,且有很大的相关性,R2分别为0.9875,0.9278 和0.9189。

图7 不同纤维浓度乙醇提取液(SDFE、TDFE、IDFE)的铁还原能力比较Fig.7 Comparison of FRAP assay of ethanol extracts(SDFE,TDFE,IDFE)at different concentrations of dietary fiber

表4 SDFE、TDFE、IDFE 抗氧化指标的线性分析Table 4 Linear analysis of antioxidant indices of SDFE,TDFE,IDFE

3 结论

竹笋中的蛋白质含量高达28.2%,且其氨基酸种类丰富;膳食纤维的量为70%,但可溶性膳食纤维的含量仅为5.53%。采用纤维素酶解法对竹笋进行改性处理,对酶解的pH 值、酶解温度、酶的添加量以及酶解时间进行单因素试验和正交试验,得出最佳的pH 值为5.0;酶解的最适温度为45 ℃;酶的适宜添加量为0.7%;最佳酶解时间为3.5 h。竹笋膳食纤维乙醇提取液SDFE、TDFE以及IDFE均具有一定程度的抗氧化活性,且DPPH 自由基清除率、ABTS+自由基清除率以及铁还原能力与纤维浓度均有较强的正相关性。

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