整体柱固定化胰蛋白酶反应器的设计及其在水解β-乳球蛋白中的应用

茅宇虹， 李仁宽， 叶秀云

(福州大学生物科学与工程学院， 福建省海洋酶工程重点实验室， 福建 福州 350108)

0 引言

β-乳球蛋白(β-Lactoglobulin, β-Lg)是牛乳中的主要蛋白质， 约占乳清总蛋白的80%. 由于母乳中不含该蛋白， β-乳球蛋白一直被认为是婴幼儿的主要过敏原之一[1]. 酶法水解是降低蛋白质过敏性的常用方法. 胰蛋白酶(Trypsin, EC3.4.21.4)特异性水解精氨酸(Arg/R)和赖氨酸(Lys/K)的C端肽键. 通过胰蛋白酶水解β-乳球蛋白不仅可显著降低其致敏性[2]， 还可释放5种生物活性肽[3].

市售的胰蛋白酶主要来源于动物， 如牛胰脏和猪胰脏. 原料不足及分离纯化成本高昂大大限制了其在食品工业中的广泛应用. 固定化不仅可提高游离酶的稳定性， 还可实现其重复使用， 从而降低使用成本. 然而， 底物与产物在固定化酶反应器中的扩散局限性往往严重阻碍了固定化酶分子与底物的接触， 从而引起水解效率的降低[4].

为了解决扩散限制问题， 基于整体柱的固定化胰蛋白酶近年来备受关注[5-7]. 整体柱是由单体、 引发剂与致孔剂等混合物通过热引发或光引发聚合而成的整体材料[8]. 相较于传统的多孔颗粒， 整体柱往往具有高孔隙率和低扩散限制的优点， 可避免因扩散及逆流问题所导致的底物与酶无法接触[9-10]. 然而， 绝大多数所报道的固定化胰蛋白酶反应器专为质谱分析研究而设计， 处理的底物量往往为微克级. 这与应用于食品工业中蛋白质水解物的生产相距甚远. 在食品工业的应用中， 固定化酶反应器不仅需具备高活性， 还需处理大量底物. 高底物处理量往往极易导致因底物和产物的残留而引起的反应器堵塞问题. 理论上， 相对更大的孔径可保证其在实际应用中的高流速与高处理量.

本研究旨在制备适用于生产蛋白质水解物的固定化胰蛋白酶反应器. 以修饰了醛基官能团的聚甲基丙烯酸甲酯的大孔径(6.0、 2.1 μm)整体柱为载体， 通过共价固定制备系列固定化胰蛋白酶反应器. 从固定化得率、 酶比活及重复使用性等方面对其进行系统评价. 此外， 以β-乳球蛋白为底物， 探究反应器对该底物的水解效率. 前期工作已系统比较了不同水解环境(pH值、 无机盐与有机溶剂)对固定化胰蛋白酶与游离胰蛋白酶的水解效率及酶切位点特异性的影响[11-13]. 因此， 本研究重点考察固定化酶反应器特有的参数-流速， 对水解蛋白质效率的影响.

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

根据Toro-Sierra等[14]的方法， 以分离乳清蛋白粉为原材料， 通过膜分离得到β-乳球蛋白(干物质含量98.6%(质量分数)， β-乳球蛋白纯度≥99%).

胰蛋白酶(Trypsin， 来源自牛胰脏)购自美国Sigma-Aldrich公司， 以Nα-苯甲酰基-L-精氨酸乙酯(BAEE)为底物的酶活≥10 000 U·mg-1. 盐酸苯甲脒(benzamidine hydrochloride, BAHC)、 2-(N-吗啉基)-乙磺酸(2-(N-morpholino)-ethanesulfonic acid， MES)、 2-甲基吡啶硼烷(2-borane picoline 2-PB)、 氰基硼酸(NaCNBH3)、 乙醇胺(ethanolamine)、 三(羟甲基)氨基甲烷(tris(hydroxymethyl)aminomethane， Tris)、 氯化钠(NaCl)、 氢氧化钠(NaOH)、 盐酸(HCl)、 氯化钙(CaCl2)、 醋酸(CH3COOH)、 乙醇(C2H6O)、 三氟乙酸(trifluoroacetic acid， TFA)、 二硫代苏糖醇(dithiothreitol， DTT)、 氯乙酰胺(chloroacetamide， CAA)、 乙腈(C2H3N)等均购自美国Sigma-Aldrich公司， 其中乙腈为色谱纯， 其余均为分析纯.

1.2 固定化酶反应器的制备

基于整体柱的固定化胰蛋白酶反应器(monolith based immobilized trypsin reactors, MITRs)采用具有醛基官能团修饰的聚甲基丙烯酸甲酯整体柱(CIMTM-ALD)为载体. 该载体由BIA Separations d.o.o. 公司(斯洛文尼亚)提供， 其具体尺寸信息如图1-A部分所示. 游离胰蛋白酶上的氨基与整体柱内表面官能团醛基通过席夫碱反应形成多点共价固定， 如图1-C部分所示， 固定步骤如图1-D部分所示.

图1 CIMTM-ALD整体柱尺寸及胰蛋白酶固定化流程

胰蛋白酶固定得率R(mg/MITR)可由式(1)计算得， 其中溶液中胰蛋白酶含量通过液相色谱分析根据峰面积确定.

R=Δc×V1-c′×V2

(1)

其中： Δc为胰蛋白酶溶液固定前后的浓度差；V1为所用的胰蛋白酶溶液体积(5 mL)；c′为固定后冲洗液中的胰蛋白酶浓度；V2为所用冲洗液的体积(10 mL).

1.3 胰蛋白酶酶活的测定

1.3.1 游离胰蛋白酶的酶活

采用连续分光光度速率测定法(A253， 光程=1 cm)， 以BAEE为底物测定胰蛋白酶活性. 一个BAEE单位的胰蛋白酶酶活(U)为每分钟产生0.001的ΔA253， pH值为7.8或8.7(0.1 mol·L-1Tris-HCl)， 反应温度为25 ℃， 反应体积为3.20 mL.

1.3.2固定化胰蛋白酶的酶活

将MITR接入Akta系统后， 采用20 mL去离子水冲洗. 使用0.1 mol·L-1Tris-HCl(pH=7.8或8.7)缓冲液预平衡反应器(5 mL·min-1)后， 将10 mL 10 mmol·L-1BAEE(0.1 mol·L-1Tris-HCl, pH=7.8或8.7)底物溶液以10 mL·min-1的流速通过MITR， 流出液通过自动收集器收集(每管2 mL). 为充分排除Akta体系死体积的影响， 取第3管收集液稀释50倍后于253 nm处测定其吸光度. 固定化酶酶活U*为在该反应条件下每分钟水解 BAEE产生 Nα-苯甲酰基-L-精氨酸(BA)的微摩尔量， 由式(2)计算得.U*可通过乘以系数270转化为BAEE酶活单位U[15].

(2)

其中： ΔA为BAEE溶液通过MITR前后的吸光度差；F为流速(10 mL·min-1)； Di 为测定吸光度时的稀释倍数(50)；L为光路径(1 cm)；ε为BA在253 nm处的摩尔吸光数(808 mol-1·cm-1)[16].

1.4 固定化胰蛋白酶反应器渗透性的测定

在Akta系统中， 将去离子水分别以不同流速循环， 分别记录Akta系统背压与接入MITR后的背压. 在相同流速下， 这两个背压值的差值即为由MITR所引起的压降值. 根据Podgornik等[17]的研究， MITR的渗透性(B， m2)可根据其在不同流速下的压降值公式(3)计算得.

(3)

其中：F为流速(mL·min-1)； Δp(MPa)为MITR所引起的压降值；η为流体黏度(去离子水黏度为0.877 mPa·s)；D、d与h分别为MITR的外径、 内径与高度(m)(见图1-A部分).

1.5 β-乳球蛋白的水解

底物预处理： β-乳球蛋白粉于去离子水中搅拌溶解过夜(4 ℃, 150 r·min-1磁力搅拌). 放置至室温后将pH值调节至4.6， 离心去除沉淀蛋白.

所有水解反应均在Akta系统中以循环模式进行(25±1 ℃)， 各水解条件分别进行3次平行实验， 且以随机错开模式安排实验顺序， 减少MITRs因使用性能下降所导致的实验结果偏差. 每次实验后， 分别采用20 mL去离子水， 100 mL 0.5 mmol·L-1NaOH + 5 mmol·L-1NaCL溶液(pH=10.5)以及50 mL去离子水清洗MITR(5 mL·min-1)， 并采用20 mL含1 mmol·L-1CaCl2与5%(体积分数)乙醇的20 mmol·L-1醋酸溶液(pH=3.5)润洗后储存于4 ℃环境中.

1.5.1流速的影响

20 mL 0.1 mol·L-1Tris-HCl 缓冲液预平衡MITRs后， 用16 mL 底物溶液(10 mg·mL-1， pH=8.7)以10 mL·min-1的流速润洗MITR， 剩余的100 mL底物溶液于不同流速下进行循环水解. 在水解过程中， 分别于不同时间取样1 mL待分析.

1.5.2 pH-stat水解模式

MITR经预平衡及底物溶液润洗后， 100 mL β-乳球蛋白溶液(10 mg·mL-1)以15 mL·min-1的流速循环通过MITR. 采用pH-stat水解法， 通过滴加0.1 mol·L-1的NaOH溶液维持水解过程中pH值的稳定， 并通过实时记录所用的NaOH溶液体积计算水解度. 水解度(degree of hydrolysis, DH)可根据式(4)计算得[18]. 在水解过程中， 分别于不同间隔时间取样1 mL待分析.

(4)

1.6 β-乳球蛋白的定量分析

通过高效液相色谱(reversed-phase high-performance liquid chromatography， RP-HPLC)定量分析β-乳球蛋白的含量. 所采用的HPLC系统为安捷伦1100系列(美国Agilent Technologies公司)， 色谱柱为PLRP-S-300 Å(150 mm ×4.6 mm， 德国Eppelheim公司). 将各待测样品稀释2倍后调节其pH值至4.6， 采用0.45 μm纤维素膜过滤该样品后， 取20 μL进行分析. 洗脱液A为含0.10%(体积分数， 下同)TFA的去离子水， 洗脱液B为含0.05%TFA的80%乙腈/水溶液. 洗脱梯度： 溶剂B的体积分数由起始的43%于13 min内增加55%. 流动相的流速恒定为1.0 mL·min-1， 温度40 ℃， 紫外检测器的检测波长226 nm.

以纯度为99%的β-乳球蛋白A与B(美国Sigma Aldrich公司)为标准品建立标准曲线后， 根据样品的保留时间及峰面积计算样品中β-乳球蛋白的含量.

1.7 水解产物的HPLC分析

表1 水解产物色谱分析的洗脱液梯度

预处理(还原二硫键)： 将水解产物样品用去离子水稀释2倍后取1 mL加入150 μL 80 mmol·L-1的DTT并震荡45 min(pH=8， 温度37 ℃)， 然后加入200 μL CAA(400 mmol·L-1)混合均匀后于黑暗环境中静置30 min.

采用安捷伦1100系列HPLC系统分析. 色谱柱型号为Kinetex-XB-C18-100 Å(100 mm ×4.6 mm， 美国Phenomenex公司). 流动相与节1.6中所述一致. 洗脱梯度如表1所示. 该分析在60 ℃和1.5 mL·min-1的流速下进行， 紫外检测器的检测波长为214 nm.

1.8 数据处理

色谱数据采用安捷伦ChemStation分析. 其它实验数据采用Origin 2018计算分析并作图.

2 结果与分析

2.1 固定化胰蛋白酶反应器的表征

2.1.1 胰蛋白酶的固定化得率

本研究比较不同还原剂体系对胰蛋白酶固定化得率及活性的影响， 结果如表2所示. 还原剂2-PB的使用导致了胰蛋白酶固载量的显著降低. 这可能是因为2-PB分子相较于其他两种还原剂较大， 限制了其还原席夫碱的能力[19]. 由于2-PB参与的还原反应相对温和， 对蛋白结构影响小， 因此方案1中的固定化胰蛋白酶的酶活显著高于其它方案. 鉴于NaBH4对蛋白结构的破坏性， 该还原剂仅于封闭残留官能团时使用， 并未在固定化过程中应用. 胰蛋白酶的固载量在方案2、 3中并无显著变化， 但应用NaBH4依旧降低了固定化胰蛋白酶的比活. 据生产商信息， 孔径大小分别为2.1和6.0 μm的整体柱的表面积分别为5.0和2.0 m2·g-1. 由于比表面积的减少， 6.0 μm-MITR中酶的总固载量均显著少于2.1 μm-MITR. 然而， 结合MITRs的固有表面积， 6.0 μm-MITR中的胰蛋白酶分子单位固载率为0.75～1.60 mg·m-2， 高于2.1 μm-MITR(0.68～1.00 mg·m-2). 这说明整体柱孔径的增大事实上有助于酶分子的固定.

据报道， 游离胰蛋白酶的最适pH值为 7.8～8.1， pH值的升高或降低往往导致酶蛋白结构的变化从而影响其活性[3]. 如表2所示， 相较于pH=7.8， 游离胰蛋白酶的酶活在pH=8.7时降低了18.6%， 而多点共价固定的胰蛋白酶的比活不仅没有降低， 还均略微增加. 然而， 共价固定法易造成酶分子灵活性的降低并可能引起空间位阻， 从而降低固定化酶的活性. 本研究中， 固定化胰蛋白酶的比活相较于其游离态降低了50%～80%.

表2 不同方案下胰蛋白酶固定于ALD-CIMTM 整体柱的得率及酶活

2.1.2固定化酶反应器的柱压及渗透性

6个MITRs在不同流速下的柱压均呈线性上升， 如图2(a)所示. 这表明所使用的整体柱材料在15 mL·min-1的流速下没有发生压缩形变. 2.1 μm-MITR在15 mL·min-1时柱压为0.20～0.25 MPa， 而6.0 μm-MITR在该流速下的柱压低于0.05 MPa. 据生产商信息， 该整体柱耐受柱压可高至2.0 MPa， 因此理论上可在更高流速下应用. 根据不同流速下的柱压及公式(3)计算所得的渗透性如图2(b)所示. 在孔隙率不变的情况下， 所用整体柱的孔径由2.1 μm 增加到6.0 μm， 渗透性增加了5倍左右.

图2 不同流速下MITRs的柱压及渗透性.

2.2 固定化胰蛋白酶水解β-乳球蛋白

N3与N4的总酶活最高， 因此被用于β-乳球蛋白的水解实验. 此外， 固定化胰蛋白酶的酶活在pH=8.7时高于pH=7.8时， 因此水解反应在pH=8.7下进行.

2.2.1流速的影响

在基于大孔整体柱的反应器中， 底物主要通过对流方式与固定化酶接触， 因此传质速度主要由流速决定. 本研究比较N3、 N4在不同流速下水解β-乳球蛋白的能力， 结果如图3所示. 无论是2.1 μm还是6.0 μm孔径的MITR， 其水解β-乳球蛋白的能力均随着循环流速的增大而增加. 例如， 在0.5 mL·min-1的流速下， N3在2 h内可水解25%β-乳球蛋白， 而在同样水解时间下将循环流速提高至10.0 mL·min-1， 50%β-乳球蛋白被降解. 显然， 流速的提高大大增加了MITRs内的传质效率， 因此提高了其水解底物蛋白的能力.

图3 N3与N4在不同流速下水解β-乳球蛋白的效率

2.2.2 pH-stat法水解模式

图4 N3与N4循环水解β-乳球蛋白过程中水解度与残留β-乳球蛋白含量的变化

理论上， 胰蛋白酶水解β-乳球蛋白最大水解度可达11.11%[3]. 经过6 h的循环水解， 水解度分别为10.1%(N3)与6.9%(N4)， 如图4所示. 其中， 使用N3的水解度在最后的1 h内只增加了0.2%， 说明其水解度已接近最大值. N3的整体酶活是N4的1.5倍， 这与两者水解β-乳球蛋白的效率十分相符. 由此可见， N3与N4的孔径差异对传质效率并无明显影响. 此外， 在前期研究中[11]， 游离胰蛋白酶水解β-乳球蛋白往往在初期反应迅速， 随后由于底物的减少以及游离酶的自降解而逐渐减缓. 固定化胰蛋白酶虽避免了自降解问题， 但由于其灵活性的降低， 并未出现初期十分迅速的反应阶段. 此外， 水解过程中残留蛋白含量的变化如图4(蓝色)所示. 在240 min时(DH 8.8%)， N3的水解产物中几乎已检测不到完整的β-乳球蛋白， 而采用N4水解360 min后， 14.2%β-乳球蛋白还未被降解.

2.2.3水解产物的分析

将经N3与N4水解的β-乳球蛋白水解物分别经含10 ku与3 ku过滤膜的离心管过滤后采用高效液相色谱分析， 结果如图5所示.

图5 N3与N4水解β-乳球蛋白产物的色谱分析

N3的水解产物在过滤前后无明显变化， 说明该水解产物的相对分子质量均小于3 ku(图5(a))； 而N4的水解产物中依旧含有相对分子质量大于10 ku的多肽(见图5(b)). 此外， 较多在N3水解产物中检测到的肽， 并未出现在N4的水解产物中. 这说明这些肽在水解反应的后期释放.

2.3 固定化酶反应器使用的重复性

MITRs的稳定性和可重复使用性取决于酶活以及渗透性(柱压)的稳定性. 为了系统研究孔径大小对其的影响， N3与N4被重复用于β-乳球蛋白的水解实验. 在10 mg·mL-1的β-乳球蛋白溶液的单次6 h循环水解实验中， 柱压的变化如图6所示. 由于N3孔径较小， 其背压约为N4的4倍. 此外， 在6 h的连续水解实验中， N3的柱压从0.30 MPa增加到0.33 MPa， 而N4的背压几乎完全保持不变. 这可能是由于β-乳球蛋白分子及其水解产物在N3中的非特异性吸附.

为了探究该非特异性吸附问题是否可通过现有的冲洗步骤消除， 本研究在每次水解实验及清洗后均记录N3与N4的渗透性以及酶活. 在用N4水解β-乳球蛋白(10 mg·mL-1)的18次实验中(前3次循环为6 h， 其余每次持续3 h)， 酶活性和柱压基本保持不变， 如图7所示. 对于N3， 其柱压在前10个循环中并没有明显下降， 这表明冲洗步骤具有一定效果. 然而， 随着使用次数的不断累积， N3的渗透性逐渐下降. 有趣的是N3的酶活在18次重复使用中几乎没有显著变化. 此外， 在连续水解实验后， N3与N4于4 ℃储存超过30周， 其酶活和渗透性均十分稳定.

图6 N3与N4水解β-乳球蛋白溶液时的柱压变化

图7 N3与N4在18次重复使用中酶活与渗透性的变化

3 结语

本研究采用大孔径(2.1 μm与6.0 μm)的有机整体柱为载体， 比较不同还原剂对所制备的固定化酶反应器的固载量及酶比活的影响. 相对温和的2-甲基吡啶硼烷可提高酶的比活但大大降低了固载量. 所制备的MITRs可有效水解β-乳球蛋白， 其中2.1 μm-MITR可在6 h内使100 mL 10 mg·mL-1的β-乳球蛋白溶液水解度达到10.1%(理论最大值为11.1%)， 该水解产物主要为相对分子质量于3 ku的小肽. 值得注意的是， 本研究中的水解时间为循环时间. 由于MITRs的孔体积为0.6 mL， 固定化胰蛋白酶与底物的有效接触时间比循环时间短得多. 此外， 2.1 μm-MITR 在10次重复使用后， 由于现有的清洗方法无法完全去除残留的蛋白质， 其柱压逐渐上升但酶活几乎保持不变. 6.0 μm-MITR的柱压及酶活在18次重复使用中均十分稳定.