NPM1在肾癌组织中的表达及临床价值

崔璨璨，何成彦，郭 贺，李晓欧

(1.吉林大学中日联谊医院 a.检验科;b.体检中心，吉林 长春130033；2.吉林省肿瘤医院 检验科)

近年来，肾癌的发病率呈现逐年递增的趋势[1]，在泌尿系统肿瘤中仅次于前列腺癌和膀胱癌。应用蛋白质组学技术对肾癌组织和癌旁组织中的蛋白进行定性定量研究[2]，是寻找肾癌肿瘤标志物的关键。本研究探讨NPM1在肾癌组织中的表达量，为肾癌的早期诊断和筛查提供方向。

1 材料与方法

1.1 研究对象

本研究共纳入了18例经病理学检测诊断为TNMIII期、无远处转移且组织学亚型为肾透明细胞癌的患者作为研究对象。样本在吉林大学中日联谊医院2018年1月-2018年12月期间采集，采集前研究对象均未接受任何临床干预治疗并签署了相关的知情同意书，样本包括肾癌组织和癌旁组织，完成采集后，进行液氮速冻，并存于-80℃的冰箱中备用。

1.2 仪器和试剂

Easy-nlc1000超高效液相色谱仪(美国Thermo Scientific公司)、Orbitrap Fusion Lumos-tribrid质谱仪(美国SCIEX公司)、毛细管液相色谱柱(美国RESTEK)、电泳仪(美国Bio-Rad公司)。PBS、考马斯亮蓝G250、二硫代苏糖醇(DTT)、NH4HCO3、碘代乙酰胺(IAM)、FA及CAN均购自美国TEDIA公司。RIPA裂解缓冲液、RNA酶、DNA酶、测序级胰蛋白酶及NPM1单克隆抗体均购自Cambridge Isotope Laboratories公司。

1.3 方法

1.3.1提取及测定样本总蛋白 将采集的样本于-80℃的冰箱中取出，PBS充分清洗、液氮研磨成粉末状后，加入适量的RIPA裂解缓冲液、RNA酶和DNA酶。应用离心机，在4℃下，对样本以12 000 rpm 转速进行15 min离心，上清液即可视为样品的总蛋白。应用考马斯亮蓝法(Bradford法)对全部样本的总蛋白浓度进行测定，并依据结果绘制相关的蛋白质浓度标准曲线。

1.3.2蛋白质多肽混合物的制备 室温下，自然融化存放于冰箱中的样本。对每个样本进行溶解稀释，先加入样本体积5倍且浓度为50 mmol/L的NH4HCO3溶液，后加入浓度为1 mol/L的DTT，使样本能够调定至20 mmol/L。完成上述步骤后，将样本放置于黑暗条件下，56℃静置1 h。样本严格冷却至室温，加入1 mol/L的IAM，确保浓度最终调定为50 mmol/L，并于黑暗条件下再次静置1 h。样本加入胰蛋白酶(比例为50∶1)，在37℃水浴箱中进行12 h的培养，蛋白质多肽混合物制备成功后将其全部冻存于-80℃的冰箱中，以进行下一步实验。

1.3.3二维高pH反相高效液相色谱-质谱技术 应用反相色谱柱进行样本色谱的分离和分析，时限为1 h，洗脱梯度为5%-30%的缓冲液(0.1%FA，99.9%CAN；流速0.3 mL/min)，每分钟以一个分数收集洗脱肽，通过串联TripleTOF5600质谱仪(全扫描分辨率40000，二级扫描分辨率20000)进行相关的质谱分析，鉴定多肽混合物，确保每个样本完成三次扫描。结果上传至iProx数据库中。

1.3.4免疫印迹试验 使用免疫印迹试验分析NPM1在18例样本中的表达量，以验证NPM1在高效液相色谱-电喷雾串联质谱技术中的结果。

1.4 统计学方法

2 结果

2.1 NPM1二维高pH反相高效液相色谱-质谱技术分析结果

对肾癌及癌旁组织进行二维高pH反相高效液相色谱-质谱技术分析，结果显示，样本中共有差异表达蛋白23个，其均满足蛋白谱图数比值≥1和样本谱图数差值≥72这两个条件。在23个肾癌组织差异表达的蛋白中共有15个上调蛋白和8个下调蛋白，详细内容如表1所示。NPM1为上调蛋白，质谱图结果见图1。

表1 肾癌及癌旁组织差异表达蛋白

图1 NPM1质谱图结果

2.2 NPM1免疫印迹试验分析结果

应用免疫印迹试验对NPM1二维高pH反相高效液相色谱-质谱的结果加以验证，试验表明NPM1的表达量显著上调，明显高于癌旁组织，如图2所示。

3 讨论

人类NPM基因家族蛋白共包括三种亚型：NPMl、NPM2以及NPM3，其中转录功能主要通过NPMl实现[3]，而其余两种蛋白的转录和编码功能尚不可知。NPMl是一种含有294 个氨基酸的核仁穿梭磷蛋白，快速穿梭功能决定了NPMl能够参与到众多细胞生物学过程中[4]，例如发挥组蛋白的分子伴侣功能、对前核糖体进行调节的装配功能、DNA修复功能、细胞凋亡功能以及协助中心体生物的合成功能等，除此之外，NPMl还能同时参与到肿瘤的发生和发展中[5]，影响恶性细胞的生长速度，既可充当原癌基因又能成为抑癌基因。已有研究表明NPMl在突变或持续高表达的情况下，可致使急性髓系白血病的发生[6],为目前与之最具相关性的蛋白之一[7]。更有研究指出NPMl表观遗传的改变可增加前列腺癌的发病概率[8]。除此之外，NPMl还能通过介导大肠癌、膀胱癌、肺腺癌等癌症的信号通路促发肿瘤耐药机制的形成[9-10]，从而加重临床治疗的困难性。NPMl独特的生物学特性，为其能够成为更多癌症的候选标志物提供了前提。

图2 NPM1在癌旁组织(A)、肾癌组织(B)中表达情况

近年来，蛋白质组学技术发展迅猛[11]，已成为医学领域中检测和分析大分子蛋白的重要手段之一[12]。二维高pH反相高效液相色谱-质谱技术不仅能够分析大分子蛋白更能有效的识别浓度较低的小分子蛋白，特异性和灵敏度较高，具有高通量的特点，是对蛋白质进行定性和定量的主要方法。

早期肾癌难以通过典型的临床症状被发现[13]，部分患者在就诊时已为晚期转移性肾癌，即便进行放射、化学治疗，也无法达到临床治愈，故新型肿瘤标志物的发现尤为重要[14]。本研究应用二维高pH反相高效液相色谱-质谱技术分析18例患者的肾癌及癌旁组织差异表达蛋白，建立了相关的差异表达蛋白质谱图，共有差异表达蛋白23个， NPMl为显著上调蛋白，然后利用免疫印迹试验对色谱-质谱的结果进行验证，发现配对的癌旁组织中NPMl的表达量显著低于肾癌组织中的表达量，从而能够说明NPMl可能成为诊断肾癌的新候选肿瘤标志物，对肾癌的形成和发展具有一定的临床意义。本研究样本量较少，因此，在下一阶段的工作中，研究组将扩大样本量，继续深入探讨NPMl在肾癌发生和发展中起到的具体机制，以期为肾癌的诊断和治疗提供新的靶点。