禁欲天数对体外受精和卵胞浆内单精子注射胚胎发育及妊娠结局的影响

陶林林，李国臻，杨志伟，耿亚松，戴芳芳，郭钰英，霍志欣，郑波

随着辅助生殖技术的不断发展，如何提高妊娠率、降低多胎率是生殖工作者一直在研究的问题。影响辅助生殖技术妊娠率的因素有很多，包括卵子质量、精子质量、促排卵方案及胚胎培养环境等，其中精液质量的好坏直接影响临床妊娠结局[1]，影响精液质量的因素有很多，如年龄、取精环境、季节、禁欲天数等[2-3]。关于禁欲天数对于精液质量及宫腔内人工授精(intrauterine insemination，IUI)妊娠结局的影响，国内外均有大量的研究，但禁欲天数对于体外受精-胚胎移植(in vitro fertilization-embryo transfer，IVF-ET)的影响等鲜有报道，本研究将禁欲天数分为两组，比较不同禁欲天数对体外受精/卵胞浆内单精子注射-胚胎移植(in vitro fertilization,IVF/intro cytoplasmic sperm injection-embryo transfer ，ICSI-ET)胚胎发育及妊娠结局的影响，旨在探讨禁欲天数与IVF/ICSI-ET妊娠结局之间的关系，为临床应用提供一定的理论依据。

1 资料与方法

1.1 研究对象

回顾性分析在邢台不孕不育专科医院生殖中心2017年1月至2019年12月行IVF或ICSI治疗的患者，共2 167个周期，包括1 699个IVF周期(A组)和468个ICSI周期(B组)。分别根据男方禁欲天数的不同各分为两个亚组：A1组，IVF禁欲天数1～3 d，共806个周期；A2组，IVF禁欲天数4～7 d，共893个周期；B1组，ICSI禁欲天数1～3 d，共217个周期；B2组，ICSI禁欲天数4～7 d，共251个周期，分析不同禁欲天数对IVF和ICSI胚胎发育和妊娠结局的影响。

纳入标准:① 女方年龄<40岁；② 获卵数≥6枚；③ 促排卵方案为长方案。排除标准：① 经皮附睾精子抽吸术及睾丸精子抽吸术助孕患者；② 患有精神疾患等禁忌证及女方纵隔子宫、双子宫等子宫畸形、子宫肌瘤、子宫息肉、输卵管积水、盆腔炎症、内膜异常等疾病；③ 解冻精子助孕的患者；④ 复发性流产，既往有不良孕产史。本研究符合《赫尔辛基宣言》。

1.2 卵母细胞获取

应用常规长方案促排卵，B超监测卵泡发育，待1/3卵泡直径≥18 mm时，当晚肌肉注射人绒毛膜促性腺激素(human chorionic gonadotropin，hCG，珠海丽珠制药)5 000～10 000 U，36.5 h左右行超声引导下卵泡穿刺取卵术，卵丘卵母细胞取出后洗涤2～3遍立即放到培养箱中培养。

1.3 精液获取及受精

取卵当日手淫取精获取精液，询问患者禁欲天数并记录，所有精液经密度梯度离心处理洗涤后留取高活率的精子沉淀物及其约0.3～0.5 mL的上清液，放置培养箱备用，精液处理前后观察精液参数，精液量、精子密度、精子活率、前向运动精子百分比等，根据患者病情行常规IVF或ICSI方式授精。

1.4 胚胎培养

受精后17～20 h后倒置显微镜下观察受精情况，并记录原核(pronucleus,PN)数目：2PN为正常受精；受精后D2和D3评估卵裂期胚胎形态，记录胚胎细胞数、碎片比例、细胞大小是否均匀，根据患者及胚胎情况于受精后第3 d、第4 d或第5 d选择1～2枚质量较好的胚胎移植，出现孕酮高、过度刺激、内膜厚度异常及无可用胚胎的患者则取消移植，行胚胎冷冻。移植后2周测血hCG，移植后28 d B超监测观察妊娠情况，见孕囊确定临床妊娠，记录妊娠囊个数。

1.5 胚胎形态学评分

在受精后第2 d和第3 d，采用Gardner评分方法对胚胎进行评分。

可用卵裂胚评分：细胞数≥6枚，胚胎级别为3级及以上，无多核证据。

第4 d可用胚胎评分：胚胎发育速度为部分融合及以上。

可用囊胚评分：囊胚至少发育到囊胚完全扩张充满整个胚胎。内细胞团：形态规则，直径在60 μm以上，细胞大小均匀。融合或形态不规则，直径在60 μm以上，细胞大小不匀，有相当一部分没有融合。滋养细胞层：沿囊胚“赤道面”分布可看到少量或大量卵裂球，大小均匀或不均匀，囊胚底面的细胞形态清晰或难以辨认，滋养细胞与透明带之间有或无碎片残留。

1.6 评价指标

2 PN可用胚率=2 PN可用胚数/2 PN卵裂数；可用胚胎率=可用胚胎数/卵裂数；可用囊胚形成率=可用囊胚数/养囊胚数；妊娠率=妊娠患者数/移植患者数；种植率=种植胚胎数/移植胚胎数。

1.7 统计学分析

2 结果

2.1 两组男方精液参数分析

男方精液参数分析包含IVF和ICSI的患者，禁欲4～7 d组男方精液量显著高于禁欲1～3 d组(P<0.001)，两组精液DFI无显著差异，两组偶见活动精子及无法统计精液参数的患者占比无统计学差异，排除这部分患者，对两组剩余患者进行精液参数对比分析。禁欲4～7 d组和禁欲1～3 d组精液处理前密度、活率均无统计学差异，禁欲1～3 d组处理前前向运动精子率显著高于禁欲4～7 d组(P<0.05)，禁欲4～7 d组的前向运动精子总数显著高于禁欲1～3 d组(P<0.05)。精液处理后两组密度、活率、前向运动精子率及前向运动精子总数均无统计学差异。处理后精液活率及前向运动精子率等均远远优于精液处理前，详见表1。

2.2 体外受精和卵胞浆内单精子注射两亚组患者基本资料

IVF和ICSI两个亚组患者的女方年龄、男方年龄、不孕年限、不孕类型、不孕因素占比、基础激素值包括促卵泡生成素(follicle stimulating hormone，FSH)，黄体生成素(luteinizing hormone，LH)、hCG日激素值包括LH，雌二醇(estrogen，E2)，孕酮(progesterone，P)、体质量指数(body mass index，BMI)等比较均无统计学差异(P>0.05)，详见表2、表3。

2.3 体外受精和卵胞浆内单精子注射两亚组患者的胚胎情况及妊娠结局比较

IVF和ICSI周期两亚组的2 PN受精率、2 PN卵裂率、可用胚胎率、可用囊胚形成率、不同移植天数周期占比、移植胚胎数目及内膜厚度等均无统计学差异(P>0.05)，A2组妊娠率及种植率均显著高于A1组(P<0.05)，B1组和B2组的妊娠率及种植率无统计学意义(P>0.05)，B2组有高于B1组的趋势，详见表4、表5。

表1 两组男方精液参数分析

表2 IVF两亚组患者基本资料比较

表3 ICSI两亚组患者基本资料比较

表4 IVF两亚组患者胚胎情况及妊娠结局比较

表5 ICSI两亚组患者胚胎情况及妊娠结局比较

3 讨论

禁欲时间对精液质量的影响国内外研究较多，对于精液中精液参数，目前大部分研究者认为随着禁欲时间的延长，精液量、精子密度和精子总数增加，但精子活率下降[4-5]。但最佳的禁欲时间尚没有明确结论。贾红军等[1]研究表明禁欲时间2～≤7 d的精子浓度和活力比禁欲时间<2 d、>7 d显著升高，禁欲时间4～<6 d时前向运动精子百分比最高，而在禁欲6～≤7 d时，前向运动精子总数达到最高。刘彩霞等[6]根据禁欲天数将研究对象分为1、2、3、4、5、6、7 d七个组，比较各组精液参数及IUI妊娠率，结果是禁欲时间越长，精子活动率及前向运动精子越低，而精子量、精子密度及前向运动精子总数等数值越高。本研究与此相似，禁欲天数1～3 d前向运动精子率显著高于禁欲天数4～7 d，禁欲4～7 d组精液量及前向运动精子总数均显著高于禁欲天数1～3 d组，两组精子密度及活率等均无显著差异。精液经过密度梯度离心+上游法洗精后，提高了精液密度、活率及前向运动精子等，两组之间均无显著差异，即两组在受精前的精液参数是一致的，精液参数并不是影响妊娠结局的影响因素。

禁欲时间对精液参数的影响有了一定的共识，研究表明禁欲较长时间(>7 d)的精子浓度和活力显著降低[1]，原因可能是睾丸及附睾中的精子保存时间较长后会对精子质量产生影响，精子形态异常、精子功能受损等，进而影响胚胎发育甚至不能成功妊娠。禁欲时间较长的附睾中的部分精子已经失去受精能力，后来睾丸形成而补给的是有受精能力的，这可能是随着禁欲时间的延长，精液量、精子密度和精子总数增加，但精子活率下降的原因。因此不建议行IVF-ET胚胎移植的男方患者禁欲天数超过7 d，第五版《WHO人类精液检查与处理实验室手册》[7]推荐精液常规检查的禁欲天数为2～7 d，本研究患者禁欲天数均<8 d，有部分患者忘记了医嘱而在助孕前1 d同房。

精液参数会随着禁欲天数改变而有所改变，精子质量会随着禁欲天数改变有怎样的改变以及是否会对辅助生殖技术妊娠结局有一定的影响，是辅助生殖临床专家应该重视的问题。目前7 d内禁欲天数对IUI及IVF妊娠结局影响的相关研究并不多，有报道禁欲时间越长，精子DNA碎片指数越高[8-10]，但目前禁欲时间对DNA碎片的影响尚无定论，有研究表明禁欲天数1 d和2 d的精子DNA碎片最低，与对照组有显著差异[11]，可能是因为精子长时间暴露于精浆氧化应激微环境中，损伤了精子DNA。但并没有直接证据证明DNA碎片率与妊娠结局及活产率有关，体外受精过程中无论IVF或ICSI，均对精子有选择的过程，可能会弱化DNA碎片对妊娠结局的影响。梁晓东等[12]研究表明在排除女方基础条件影响的前提下，精液DNA完整性对第1个完整周期的妊娠率及活产率无明显影响，其累积活产率也比较相近，可能与DNA完整性来源于未经处理的精液以及移植前胚胎经过挑选有关。本研究两组精液DNA碎片无显著差异，禁欲天数对本研究人群精液DNA碎片无影响，因此两组妊娠结局的比较不受DNA碎片的影响。辅助生殖专家研究禁欲天数对于妊娠结局的影响结果不一，Borges E等[13]研究了818例IVF周期，发现与射精禁欲>4 d组比较，射精禁欲≤4 d组不会降低精子DNA碎裂指数，能够提高受精率，第3 d可用胚胎率、囊胚形成率、种植率和妊娠率。与禁欲时间2～4 d相比，禁欲1 d的种植率显著增高，妊娠率有增高的趋势。何连利等[14]的研究中，IVF受精患者禁欲天数4～7 d组妊娠率(47.5%)与禁欲天数2～3 d组(37.5%)比较，差异无统计学意义，但从数据来说禁欲天数4～7 d组有增高的趋势。本研究与其研究结果相似，禁欲天数1～3 d与禁欲天数4～7 d比较，受精率、卵裂率、可用胚胎率及囊胚形成率等均无显著差异，IVF周期禁欲天数4～7 d妊娠率和种植率显著高于禁欲天数1～3 d，ICSI周期两组之间无显著差异，但禁欲天数4～7 d妊娠率与种植率有增高的趋势。ICSI周期无差异的原因可能与ICSI受精绕过了自然选择的过程，减弱了禁欲天数对妊娠结局的影响。本研究中两亚组精液参数及DNA碎片均无显著性差异，表明妊娠结局的比较不受精液参数和DNA碎片的影响。刘睿智等[15]研究表明禁欲天数1～5 d时，顶体酶活性是稳定的，而禁欲10 d时顶体酶活性明显下降，与禁欲1 d时顶体酶活性比较差异有统计学意义，因此本研究两组顶体酶活性是无差异的。禁欲天数4～7 d妊娠结局较好的原因可能与精子核蛋白转型有关，核蛋白转型障碍可影响精子核染色质的正常凝聚和稳定性，核染色质易受损伤影响妊娠结局。在核蛋白组型转换半定量值正常患者中，禁欲时间<3 d对精子核蛋白组型转换半定量值有影响[16]，会影响患者后期妊娠结局，因此建议辅助生殖技术禁欲天数选择>3～7 d。但本研究中禁欲天数4～7 d妊娠结局较好的确切机理尚不明确。

综上所述，在IVF-ET胚胎移植技术中，男方禁欲天数在4～7 d能够显著提高IVF妊娠率及种植率，ICSI有增高的趋势，但本研究样本量较少，且导致该原因的内在机理尚不明确，仍需要大样本量随机对照及分子机理研究进行深入分析，本文旨在提醒临床专家禁欲天数对妊娠结局是有一定影响的，各中心可根据本身的数据结合理论选择合适的禁欲天数，以期改善妊娠结局。