基氏蠊螨的18S rDNA分子鉴定

李梦珠，张兰香，詹雨娟，褚凌渺，胡婷婷，李心玫，王严，孙恩涛

皖南医学院检验学院，安徽 芜湖 241002

革螨种类繁多，在自然界中分布广泛，与人类关系密切。革螨可叮咬人的皮肤引起皮炎，少数还可作为媒介传播疾病，也有一些种类可以用于生物防治[1-5]。目前，革螨种类的鉴定主要依靠形态学特征，然而革螨体积微小、形态相似、近缘种较多，仅依靠形态学方法准确鉴定革螨种类十分困难[6]。

随着分子生物学和DNA鉴定技术的不断发展和完善，利用标准基因片段对物种进行快速准确鉴定，可作为传统分类鉴定的有力补充[7]。线粒体基因(COⅠ)、核糖体基因(18S rDNA和28S rDNA)等分子标记被广泛应用于螨类的相关研究[8]。其中，核糖体DNA(rDNA)结构独特，分子量大小适中，且信息量大，是近缘种鉴别和序列分析的理想标志之一[9]。18S rDNA是核糖体DNA的重要组成部分，其不同片段的核苷酸取代率和进化率相对较低，能更好地用于生物体的分类鉴定及系统进化信息的获得[10]。本研究对革螨股、蠊螨科的基氏蠊螨(Blattisociuskeegani，B.keegani)18S rDNA基因序列进行扩增、测序和分析，建立基氏蠊螨的分子鉴定方法。

1 材料与方法

1.1样本采集、分离和形态鉴定 2018年12月，自安徽省芜湖市某储藏物中采集储藏物样本。从采集样本中初步分离革螨，在光学显微镜下挑取单只成螨制成玻片后，进行形态学鉴定[11]。

1.2DNA提取，PCR扩增、克隆和测序 参考Jia等[12]提取DNA的方法，提取单只螨DNA，将提取的DNA样本储存于-20 ℃冰箱中备用。COⅠ基因的扩增引物设计参考Webster[13]，正向引物：5′- GTTTTGGGATATCTCTCATAC-3′，反向引物：5′-GAGCAACAACATAATAAGTATC-3′。18S rDNA基因的扩增引物设计参考N Okhravi[14]，正向引物：5′-GGCGTGCTTAACACATGCAAGTCG-3′，反向引物：5′-GCGGCTGGCACGTAGTTAG-3′。

PCR反应总体积为25 μL，包含2× Taq PCR Mastermix 12.5 μL，上下游引物(5 μmol/L)各1 μL，DNA模板1 μL，加灭菌后的超纯水补足。PCR反应程序为95 ℃预变性5 min；95 ℃变性30 s，48 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s，循环34次；72 ℃终延伸10 min。取5 μL PCR扩增产物，用1%琼脂糖凝胶电泳，Marker D 2000为分子参照，电泳结束后使用凝胶成像仪观察、拍照检测。扩增后的18S rDNA序列经购自生工生物工程(上海)股份有限公司的T载体PCR产物克隆试剂盒克隆后，送至上海生工生物科技有限公司测序。

1.3序列分析 将所获得的COⅠ和18 S rDNA基因序列在Blast中进行相似性比对，结合NCBI中蠊螨属的基因序列，使用Clustal X 1.83软件进行多序列比对。基于MEGA X[15]软件进行蛋白质翻译、碱基组成和变异位点分析，以Kimura2-parameter模型计算碱基差异度，以邻接法(Neighbor-Joining，NJ)构建系统发育树。

2 结 果

2.1形态学和COⅠ基因双重鉴定 根据形态学特征鉴定，采集到的革螨为革螨股、蠊螨科、蠊螨属、基氏蠊螨。同时，将获得的长度为377 bp COⅠ基因中间区段在NCBI数据库中进行Blast比对，结果显示与基氏蠊螨具有100%的同源性。

2.2基于18S rDNA分子鉴定方法的建立

2.2.118S rDNA序列变异位点分析 选取10个基氏蠊螨个体，所获得的18S rDNA序列长为1 476 bp，基因序列一致，GenBank编号为MH916618。同时，检索蠊螨属的18S rDNA 序列，包括Blattisociustarsalis(B.tarsalis)和Blattisociuseverti(B.everti)，GenBank编号分别为KM979620和KM979619。使用Clustal X 1.83对3种蠊螨18S rDNA序列进行比对，取一致长度为473 bp的序列。经 MEGA X软件分析，473个位点中，共检测到466个保守位点，7个变异位点，变异位点占所测序列长度的1.48%(图1)。3种蠊螨18S rDNA序列均无碱基的插入和缺失，其A+T含量平均为60.75%，表现为A/T偏向性(表1)。

2.2.2相似性分析 基氏蠊螨18S rDNA序列与GenBank中蠊螨属18S rDNA序列经Blast比对显示，基氏蠊螨(Blattisociuskeegani)与Blattisociustarsalis有98.73%的相似性，与Blattisociuseverti有98.94%的相似性。

2.2.3系统发育树构建系统发育树显示基氏蠊螨(Blattisociuskeegani)与Blattisociustarsalis和Blattisociuseverti聚为一支，表明18S rDNA序列可用于基氏蠊螨的分子鉴定(图2)。

表1 基氏蠊螨与蠊螨属18S rDNA碱基组成分析(%)

图1 基氏蠊螨与蠊螨属18S rDNA基因序列比对

注：*为本研究所获得的基氏蠊螨序列。

3 讨 论

革螨作为医学媒介生物，其种类鉴定十分重要[16]。然而，革螨个体微小、生境复杂、近缘种多，仅依靠形态学方法鉴定革螨及其若虫、幼虫、卵和残体的种类存在一定的困难。目前，常用于螨类鉴定的分子标记主要包括线粒体基因和核糖体基因[8]。其中，18S rDNA是真核生物染色体上编辑核糖体小亚基的基因，此段序列具有一定的保守性，在螨类的物种鉴定和分类中起到重要作用。刘成倩[17]等根据18S rRNA基因序列设计特异性引物，判断江苏某蛋鸡场发生的体外寄生虫感染为鸡皮刺螨引起，为探索出适于诊断鸡皮刺螨病的方法提供了科学依据。王德印[18]在基于核糖体RNA基因对甲螨的分子系统学研究中，获得的18S rDNA部分序列长度为547～550 bp，仅有约4 bp的差异，说明螨类18S rDNA序列高度保守。

本研究对基氏蠊螨18S rDNA序列进行扩增、测序和分析，并与GenBank中蠊螨属18S rDNA序列进行比对和分析。结果表明，3种螨的A+T含量均大于G+C含量，均表现出A/T偏向性。473个碱基位点中共存在7个碱基变异位点，变异位点数量占该段序列的1.48%，进一步说明螨类18S rDNA序列高度保守。将本实验所获得的基氏蠊螨18S rDNA基因序列与GenBank中的蠊螨属18S rDNA基因序列比较发现，基氏蠊螨与Blattisociustarsalis和Blattisociuseverti分别有98.73%和98.94%的相似性，且进化树显示3种蠊螨聚为一支。因此，18S rDNA可用于基氏蠊螨的鉴定，是对基氏蠊螨分子鉴定方法的补充。此外，本研究在数据库中上传了基氏蠊螨的基因序列，为鉴定蠊螨属的近缘种提供了参考依据。