法氏囊活性肽BP7和BP9调节T细胞的功能研究

张则，郑阳，郝珊珊，蔡佳希，冯秀丽

(南京农业大学动物医学院/农业农村部动物细菌学重点实验室/教育部“动物健康与食品安全”国际合作联合实验室，江苏 南京 210095)

法氏囊(bursa of fabricius,BF)是禽类特有的体液免疫中枢器官，是B细胞发育成熟和抗体产生的组织器官，在免疫调节中发挥重要作用。T淋巴细胞起源于骨髓中的造血干细胞，随后T细胞转移到胸腺中成熟，既参与细胞免疫又参与体液免疫，在产生抗体过程中发挥调节作用，是免疫系统中不可缺少的重要组成部分[1]。目前法氏囊对T细胞的作用机制仍需进一步研究。

有研究发现，法氏囊组织灭活疫苗在体内保护效果优于胚苗和细胞苗[2]，暗示着其存在某种活性成分可以促进免疫反应。据Murthy等[3]报道，大剂量的法氏囊组织提取物在体外可以促进植物血凝素(PHA)诱导的淋巴细胞的转化，说明其能够不依赖于机体在体外也能发挥良好的免疫功能。Audhya等[4]在1986年首次从鸡法氏囊组织中分离出一种名为囊素三肽的生物肽，到现在为止，已经从法氏囊中发现多种活性肽，如BP5[5]、BSP-Ⅱ[6]和 BPP-Ⅱ[7]，并证实其能够参与调节B细胞发育、调节免疫反应、抗氧化、抗肿瘤等多种生物学过程[7-9]。探究法氏囊活性肽的免疫学功能和作用机理，为开发其临床应用潜力提供新的思路。

法氏囊活性肽BP7和BP9是本实验室近期研究的2种生物活性分子，已在小鼠免疫试验中证实其能够增强禽流感病毒(AIV)灭活疫苗的免疫效果[10-11]。然而，对法氏囊活性肽BP7和BP9如何调节T细胞的作用机制报道甚少。基于此，本研究以AIV灭活疫苗免疫小鼠为模型，开展了多肽调节T淋巴细胞作用的试验，为探究法氏囊活性肽调节免疫系统的分子机制提供理论基础。

1 材料与方法

1.1 主要试验材料

法氏囊活性肽BP7(氨基酸序列为GGCDGAA)和BP9(氨基酸序列为LMTFRNEGT)均由南京金斯瑞生物科技有限公司合成，纯度在98%以上；禽流感病毒株A/chicken/Shandong/LY1/2017 (H9N2) 为本实验室保存。

HRP标记山羊抗鼠IgG二抗购自联科生物公司；单组分TMB显色液、ELISA终止液均购自善清博生物公司；牛血清蛋白(BSA)、噻唑兰、DMSO均购自于上海生物生工公司；CD3+T细胞阴选磁珠购自优宁维生物公司；CD3-FITC、CD8-PE、CD4-Alex Fluro流式抗体和FITC/PI 凋亡检测试剂盒均购自美国BD公司；白细胞介素-4(IL-4)、干扰素-γ(IFN-γ)ELISA试剂盒购自武汉基因美生物公司。

1.2 H9N2抗原疫苗的制备

选取纯化后病毒H9N2作为疫苗抗原，根据《兽用生物制品质量标准》制备H9N2亚型禽流感灭活疫苗，油包水剂型，稳定无析出，黏度合格，无菌。

1.3 小鼠免疫和H9N2病毒抗体检测

6周龄SPF级ICR小鼠(购自扬州大学实验动物中心)随机分为PBS组和疫苗组，每组10只。疫苗腹腔注射小鼠，100 μg/只，于一免后14 d二免，7 d后三免， 1周后采集小鼠血清，以2 μg/mL的纯化AIV灭活抗原包被酶标板，建立间接ELISA方法[10]，检测其H9N2亚型禽流感病毒的特异性抗体效价。

1.4 脾脏淋巴细胞悬液的制备

将小鼠断颈处死，75%酒精浸泡5 min，无菌摘取脾脏，用注射器活塞在200目尼龙布研磨过滤，加入适量的PBS稀释，沿着管壁缓慢滴加在等体积的淋巴细胞分离液上，500g离心20 min，小心吸取淋巴细胞层，加入过量的无菌PBS清洗2次，调整细胞悬液浓度至1×107个/mL，静置备用。

1.5 磁珠筛选T细胞及纯度检测

将上述制备好的细胞悬液，加入适量的磁珠抗体，冰上孵育15 min，用5 mL buffer洗涤细胞，300g离心7 min，弃去上清。之后加入适量的磁珠，充分混匀，4 ℃孵育30 min。然后加入1 mL buffer并转移至流式管中，放置在磁力架上6～8 min，重复分选2次，吸取上清，离心，加入含有10%胎牛血清的RPMI-1640完全培养基重悬细胞。取少量的细胞悬液计数，加入5 μL的CD3-FITC标记抗体，避光孵育30 min，500 μL PBS重悬，流式细胞仪鉴定细胞纯度。

1.6 T细胞增殖检测

取一部分分选后的细胞悬液，加入到96孔细胞板中(105细胞/孔)。将剂量为10 ng/mL刀豆素ConA分别与BSA、BP7和BP9混匀，刺激T细胞。细胞分组为：Con组为空白对照组，ConA组为刀豆素ConA+BSA刺激组(剂量为1 ng/mL)，ConA+BP7组为刀豆素ConA+多肽BP7(剂量为1 ng/mL)刺激组，ConA+BP9组为刀豆素ConA+多肽BP9(剂量为1 ng/mL)刺激组，并在作用48 h后，按照标准的MTT方法检测2种法氏囊活性肽对T细胞活力的影响[12]。

1.7 T细胞亚型分化鉴定

取分选后的T细胞悬液，加入到六孔板中，设立与上述相同的分组，用含有10%胎牛血清的PRMI-1640完全培养基培养24 h和48 h后，离心收集细胞，加入CD3-FITC、CD8-PE、CD4-Alex Fluro流式抗体，充分混匀，常温避光孵育30 min，PBS清洗2次，500 μL PBS重悬，流式细胞仪上机鉴定。

1.8 T细胞早期凋亡分析

取分选后的T细胞悬液，加入到六孔板中，设立上述相同的分组，用含有10%胎牛血清的RPMI-1640完全培养基分别培养12、24和48 h后，离心收样，加入Annexin V-FITC 和 PI 染液，室温避光标记15 min，在1 h内通过流式细胞分析仪，上机分析。

1.9 细胞因子检测

收集培养48 h后96孔板中的细胞上清，-20 ℃分装保存。按说明书操作，应用商品化的ELISA试剂盒检测IL-4和IFN-γ细胞因子含量变化情况。

1.10 数据统计与分析

所有数据均由Excel进行统计后，Graphpad软件进行数据分析，试验数据用“平均值±标准误”表示，采用t检验进行显著性分析。

2 结果

2.1 免疫小鼠的抗体水平

分别于一免和三免后2周采集免疫小鼠血清，利用间接ELISA方法检测小鼠特异性抗体水平的变化。如图1所示，免疫小鼠在三免后AIV的特异性抗体水平较对照组明显升高，其OD值达到了0.607，且远高于一免后AIV的抗体水平。该结果说明免疫小鼠已产生良好的特异性免疫应答反应。

2.2 BP7和BP9对CD3+T细胞增殖的促进作用

为了检测法氏囊活性肽对T细胞增殖的影响，首先采用磁珠阴选T细胞，流式分析发现，磁珠筛选的免疫小鼠脾脏T细胞效果较好(图2A)，CD3+阳性T细胞占筛选T细胞的比例高达95.6%(图2B)。如图2C所示，与ConA组相比，ConA+BP7组和ConA+BP9组的T细胞的OD值明显升高，其中ConA+BP7组T细胞的OD值最高(P<0.01)。该结果说明，法氏囊活性肽BP7和BP9均促进CD3+T细胞增殖，且BP7促进T细胞活性的能力高于BP9。

注：**表示差异极显著(P<0.01)

A.淋巴细胞；B.T细胞比例；C.CD3+T细胞增殖，其中：*表示差异显著(P<0.05)，**表示差异极显著(P<0.01)。下同

2.3 BP7和BP9对T细胞亚型分化的调节作用

2.3.1 BP7和BP9对CD3+CD4+T细胞分化的影响

法氏囊多肽BP7和BP9刺激磁珠筛选的免疫小鼠T细胞，然后流式细胞术进行检测CD3+CD4+T细胞比例。结果如图3A所示，在24 h和48 h时，与ConA组相比，ConA+BP7刺激组的CD3+CD4+T细胞比例均明显升高(P<0.05)，不过ConA+BP9刺激组的CD3+CD4+T细胞比例与ConA组差异不明显(P>0.05)，说明试验剂量的BP7促进了T细胞向CD3+CD4+T细胞分化，而BP9不能活化T细胞增殖分化成CD3+CD4+T细胞，其功能机制还有待于进一步探索。

A.CD3+CD4+T细胞；B.CD3+CD8+T细胞

2.3.2 BP7和BP9对CD3+CD8+T细胞分化的影响

法氏囊多肽BP7和BP9刺激经磁珠筛选的免疫小鼠T细胞，然后流式细胞术检测CD3+CD8+T细胞比例。结果如图3B所示，在48 h时，与ConA组相比，ConA+BP7组的CD3+CD8+T细胞比例升高，且ConA+BP9组的CD3+CD8+T细胞比例也升高，不过没有达到显著差异水平(P>0.05)。而在24 h时，ConA+BP7和ConA+BP9组与ConA组相比，CD3+CD8+T细胞比例变化不大，说明多肽BP7的刺激能够促进活化T细胞增殖分化成CD3+CD8+T细胞，多肽BP9的刺激能一定程度上活化T细胞增殖分化成CD3+CD8+T细胞。

2.4 BP7和BP9抑制T细胞的早期凋亡

法氏囊多肽BP7和BP9刺激经磁珠筛选的免疫小鼠T细胞，分别在12、24和48 h采用流式细胞术检测T细胞凋亡情况，分析结果如图4所示，ConA+BP7组在12、24和48 h里的早凋细胞比例分别为9.86%、7.60%和15.50%，比同一时间的空白对照组Con、ConA组的早凋细胞比例减少，差异较为明显；ConA+BP9组在12、24和48 h里的早凋细胞比例分别为9.76%、13.25%和17.85%，也比同一时间的空白对照组Con、ConA组的早凋细胞比例少，差异也较为明显。以上结果表明多肽BP7、BP9能在48 h内一定程度上抑制T淋巴细胞的凋亡。

A.T细胞早期凋亡的流式细胞术结果；B. T细胞早期凋亡情况，其中：*、 ^、#分别表示在12、24和48 h时，ConA+BP7组、ConA+BP9组与ConA组相比差异显著(P<0.05)

2.5 BP7和BP9对脾脏T淋巴细胞中细胞因子IL-4和IFN-γ表达水平的影响

通过ELISA试剂盒检测细胞上清中的IFN-γ、IL-4的表达水平，如图5所示，与Con和ConA组相比，ConA+BP7组能显著提高Th1型细胞因子IFN-γ(80.796 ng/mL)和Th2型细胞因子IL-4(159.205 ng/mL)水平，差异极显著(P<0.01)；而ConA+BP9组Th1型细胞因子IFN-γ(33.175 ng/mL)和Th2型细胞因子IL-4的含量(42.675 ng/mL)与Con和ConA组相比差异均不显著。说明BP7能够上调Th1型细胞因子IFN-γ和Th2型细胞因子IL-4的分泌水平，有明显的活化作用。

图5 CD3+T淋巴细胞上清IFN-γ和IL-4表达水平

3 讨论

法氏囊是禽类唯一的体液中枢免疫器官，在免疫系统中占有重要地位，不仅参与体液免疫的调节，还参与调节细胞免疫[13]。以往的研究主要集中法氏囊活性肽对B细胞功能研究，对活性肽调节T细胞的报道很少，法氏囊活性肽调节T细胞的作用机制还尚不清楚。

本研究对BP7和BP9对T细胞的免疫调节活性进行验证。选择了1 ng/mL的BP7和BP9分别混合刀豆素Con A刺激磁珠分选小鼠T淋巴细胞，以检测法氏囊活性肽对T细胞功能影响。研究结果表明，BP7和BP9均能增强T细胞增殖活性。淋巴细胞亚群中CD3+、CD3+CD4+、CD3+CD8+T细胞是衡量机体细胞和体液免疫功能的金标准，了解体内免疫功能的主要途径是通过淋巴细胞亚群的检测[14]。本文以CD3+、CD3+CD4+、CD3+CD8+T细胞为机体细胞和体液免疫功能的观察指标,动态观察多肽对T细胞功能影响。结果显示， BP7和BP9对 CD3+CD4+、CD3+CD8+T细胞亚型免疫调节活性略有差异。BP7和BP9能够同时促进 CD3+CD4+T分化，BP7在48 h能够促进CD3+CD8+T细胞的分化，而BP9对CD3+CD8+T细胞无显著影响，说明法氏囊活性肽BP7和BP9可能以不同的作用机制通过影响T细胞分化来调节细胞免疫反应。

细胞凋亡是一种由基因控制的细胞自主性死亡方式, 它涉及一系列基因的激活、表达以及调控等的作用，对维持个体正常生理过程和功能表达具有重大的生物学意义[15]。为此，本研究使用Annexin V-FITC/PI法检测T细胞凋亡情况。结果显示，加入BP7和BP9刺激，T细胞的早期凋亡率明显下降，由此得知，BP7和BP9与细胞的凋亡相关，随着时间增加，T细胞的早期凋亡率有所上升，表明法氏囊活性肽BP7和BP9可能通过调节基因的表达来调控T淋巴细胞的分化成熟。Th1 细胞产生IFN-γ，而 Th2 细胞分泌IL-4。Th1、Th2 细胞分泌的细胞因子可共同调控细胞的分化与成熟。IL-4和IFN-γ是由激活的 T 细胞产生，具有重要的免疫调节作用[16-17]。法氏囊活性肽BP7能够上调IL-4和IFN-γ的细胞因子反应，而BP9对细胞因子反应无显著影响，说明BP7和BP9对T细胞的作用机制不同，但其差异仍需进一步研究。

综上所述，法氏囊活性肽BP7和BP9能够通过不同作用方式促进T细胞的增殖分化，并可能通过调控基因表达来影响T细胞生物学功能活性，为深入挖掘法氏囊活性肽在免疫系统中的作用机制提供了参考。