Exendin-4对Ⅰ型糖尿病小鼠内皮祖细胞功能及AKT/eNOS信号通路的影响

帅青云，涂 强，黄小川，付 杰，曹 政

(1.湖北医药学院，2.十堰市太和医院，湖北 十堰 442000)

缺血性血管疾病是糖尿病最常见的并发症之一，血管内皮损伤和血管生成能力障碍在糖尿病缺血性血管疾病的发生发展中起着重要作用。因此，研究如何修复受损的血管内皮，改善血管生成能力是防治糖尿病缺血性血管疾病的重要策略。内皮祖细胞(endothelial progenitor cells，EPCs)是骨髓和外周血内皮细胞的前体细胞，在血管内皮损伤修复和血管生成中起重要作用。当血管发生损伤时，EPCs可以从骨髓动员到外周血循环，通过在损伤和缺血部位的迁移和黏附，参与血管损伤修复和血管生成[1-2]。而糖尿病患者EPCs数量和功能明显降低，导致严重的缺血性血管病变[3]。因此，积极寻求改善糖尿病EPCs功能的有效手段是逆转糖尿病缺血性血管病变的关键环节。

Exendin-4作为胰高血糖素样肽-1受体(glucagon-like peptide-1 receptor，GLP-1R)激动剂，可促进胰岛素的分泌，目前主要用于2型糖尿病的临床治疗[4]。新近研究表明，除了胰岛素调节作用外，Exendin-4还具有抗炎、调节血脂、降低体质量等心血管保护作用[5-6]。然而，Exendin-4能否调控糖尿病EPCs功能活性，促进损伤血管内皮的修复，目前尚不明确。因此，本研究拟观察Exendin-4对Ⅰ型糖尿病小鼠骨髓来源的EPCs增殖、迁移、黏附及衰老的影响，并初步探讨其可能机制，以期为糖尿病血管并发症的防治提供新的理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1试剂 小鼠淋巴细胞分离液(批号：C-10831)购自美国Sigma公司；EGM-2培养基(批号：C-22121)购自美国PromoCell公司；人纤维连接蛋白(批号：F0895)购自美国Sigma公司；人重组血管内皮生长因子(批号：100-20)购自美国PeproTech公司；链脲佐菌素(批号：572201)购自美国Millipore公司；Exendin-4(批号：HY-13443)、Exendin-9-39(批号：HY-P0264)及MK-2206(批号：HY-10358)均购于美国MedChemExpress公司；RIPA蛋白裂解液、BCA蛋白浓度测定试剂盒、SDS-PAGE凝胶配制试剂盒、β-actin抗体及细胞衰老β-半乳糖苷酶染色试剂盒均购自碧云天公司;抗AKT抗体、抗磷酸化AKT (p-AKT)抗体，抗eNOS 抗体、抗磷酸化eNOS (p-eNOS)抗体购自美国Immunoway公司;其它试剂均为进口分装或国产分析纯。

1.1.2实验动物及处理 雄性8周龄C57BL/6J小鼠购自北京维通利华实验动物技术有限公司(许可证号：SCXK-京-2016-0006)，研究方案经湖北医药学院动物管理委员会批准。选取8周龄C57BL/6J雄性小鼠，连续5 d腹腔注射链脲佐菌素(50 mg·kg-1·d-1)构建Ⅰ型糖尿病小鼠模型，对照组小鼠给与0.1 mL柠檬酸钠溶液腹腔内注射,造模期间每周至少测定3次血糖。随机血糖>300 mg·d-1被确诊为糖尿病小鼠。糖尿病小鼠建模成功6个月后用于后续骨髓单个核细胞(bone marrow mononuclear cells，BMNCs)分离，并诱导分化为EPCs。

1.2 实验方法

1.2.1EPCs的分离和培养 采用密度梯度离心法分别从对照组和糖尿病组小鼠中获得BMNCs,接种至预先涂有5 mg·L-1人纤维连接蛋白，并含有血管内皮生长因子(VEGF-A)、成纤维细胞生长因子(b-FGF)、胰岛素样生长因子-1(IGF-1)、表皮生长因子(EGF)、5%胎牛血清和1%双抗的EGM-2培养基中进行细胞培养。培养4 d后，采用无菌PBS去除未贴壁细胞，即得到骨髓来源的EPCs。

1.2.2克隆形成实验 将对照组和糖尿病组小鼠BMNCs接种于24孔板(2×105个细胞/孔)中，加入EGM-2培养基中培养，糖尿病组细胞加入或不加入Exindin-4(0、1、5、10、25 μmol·L-1)培养7 d。用PBS缓冲液清洗细胞3次，于普通倒置显微镜下拍照计数。

1.2.3CCK-8检测细胞增殖 将BMNCs接种于96孔板中(2×104个细胞/孔)，在37 ℃ EGM-2培养基中加入或不加入Exindin-4(0、1、5、10、25 μmol·L-1)培养7 d,然后将含有CCK-8的100 μL新鲜培养基添加到每个孔中，并在37 ℃下孵育1 h。用酶标仪在450 nm处检测各孔的吸光度值(以空白孔进行调零)。

1.2.4细胞迁移实验 将培养d 7的EPCs消化重悬并计数，按照5×104个EPCs接种到Boyden小室的上室，小室下室加入700 μL EGM-2培养基(含或不含50 μg·L-1VEGF)。37 ℃培养24 h后，取出Boyden小室，轻轻擦拭掉上室未迁移的细胞，于4%多聚甲醛中固定10 min，DAPI染色，荧光显微镜下计数。

1.2.5细胞黏附实验 胰酶消化培养至d 7的EPCs，按照3×105个EPCs接种于预先包被人纤维粘连蛋白的12孔板中，于5%的CO2在37 ℃下培养5 h后弃掉未黏附细胞，4%多聚甲醛固定，0.1%结晶紫染色后于倒置显微镜下计数。

1.2.6细胞衰老实验 Exendin-4处理EPCs 7 d后，弃除细胞培养基，用4%多聚甲醛固定细胞10 min，加入碧云天生产的β-半乳糖苷酶染色液，放置37 ℃不含CO2的温箱中孵育24 h后于普通显微镜下观察拍照，被染成蓝色的即为衰老细胞。

1.2.7Western blot检测p-AKT/AKT和p-eNOS/eNOS蛋白表达 分别收集各组EPCs，预冷PBS漂洗2次，加入RIPA缓冲液裂解细胞，在4 ℃条件下12 000 r·min-1离心20 min，收集细胞蛋白，BCA试剂盒测定蛋白浓度，用SDS-PAGE分离胶分离蛋白，将蛋白转至硝酸纤维素膜上，加入封闭液室温封闭1 h，Western blot洗涤液漂洗膜2 min，别加入稀释好的β-actin(1 ∶1 000;AA128；碧云天)、p-AKT(1 ∶1 000；YP0006；Immunoway)、AKT(1 ∶1 000；YT0185；Immunoway)，p-eNOS(1 ∶1 000；YP1238；Immunoway)和eNOS(1 ∶1 000；YM3164；Immunoway)一抗4 ℃孵育过夜，Western blot洗涤液充分漂洗3次，10 min/次，然后加入HRP标记的二抗室温孵育1.5 h，Western blot洗涤液充分漂洗3次，10 min/次，用ECL显色液进行显色。利用ImageJ软件对目的条带进行分析(以β-actin为内参)。

2 结果

2.1 Exendin-4上调Ⅰ型糖尿病小鼠克隆形成及增殖能力为探讨Exendin-4对糖尿病小鼠EPCs克隆形成及增殖能力的影响,本研究将糖尿病小鼠BMNCs与含或不含Exendin-4(0、1、5、10、25 μmol·L-1)的EGM-2培养基在37 ℃下培养7 d后分别检测其克隆形成能力及增殖能力。克隆形成实验及CCK-8分析表明，Exendin-4以剂量依赖性改善Ⅰ型糖尿病小鼠EPCs增殖能力，其中Exendin-4以10 μmol·L-1的浓度作用最为显著(Fig 1，P<0.01)，而高浓度的的Exendin-4(25 μmol·L-1)可明显抑制细胞增殖，甚至低于糖尿病组(Fig 1，P<0.01)，这可能与过高浓度的Exendin-4导致细胞死亡相关。

2.2 Exendin-4改善Ⅰ型糖尿病小鼠EPCs迁移能力采用Transwell小室法观察10 μmol·L-1Exendin-4处理对糖尿病小鼠EPCs体外迁移能力的影响。与糖尿病组相比，Exendin-4组EPCs体外的迁移能力明显改善(Fig 2，P<0.05)。血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)是一种重要的促血管生成活性的生长因子,可增加血管通透性,促进细胞迁移,对EPCs的生长也存在重要作用，在本研究中，我们也发现VEGF可进一步增强EPCs迁移能力，这与既往相关报道一致[7]。

Fig 1 Effects of Exendin-4 in different concentrations on colony-formation and proliferation ability of EPCs n=4 )A：NDM；B：DM；C：DM+Ex-4(1 μmol·L-1)；D：DM+Ex-4(5 μmol·L-1)；E：DM+Ex-4(10 μmol·L-1);F:DM+Ex-4(25 μmol·L-1).**P<0.01 vs NDM-EPCs;#P<0.05,##P<0.01 vs DM-EPCs

Fig 2 Representative photographs and quantification analysis of migratory activity of EPCs n=4)**P<0.01 vs NDM-EPCs;#P<0.05 vs DM-EPCs

2.3 Exendin-4改善Ⅰ型糖尿病小鼠EPCs黏附能力与正常对照组小鼠相比，糖尿病组小鼠EPCs黏附能力明显下降(Fig 3，P<0.01)；与糖尿病组EPCs相比，Exendin-4组EPCs体外黏附能力提高(Fig 3，P<0.05)。

Fig 3 Representative photographs and quantification analysis of adhension of EPCs n=4)**P<0.01 vs NDM-EPCs;#P<0.05 vs DM-EPCs

2.4 Exendin-4改善Ⅰ型糖尿病小鼠EPCs衰老采用β-半乳糖甘酶染色法观察EPCs衰老的变化。与糖尿病组EPCs相比，Exendin-4处理组EPCs衰老明显减少(Fig 4，P<0.01)。

2.5 Exendin-4对糖尿病小鼠EPCs GLP-1R/Akt/eNOS信号通路的调控作用Western blot结果分析显示，Exendin-4处理可显著增加糖尿病小鼠EPCs AKT/eNOS蛋白磷酸化水平(Fig 5，P<0.05或P<0.01)。为进一步研究GLP-1R/AKT/eNOS信号通路是否参与Exendin-4对糖尿病小鼠EPCs功能的调控作用，在Exendin-4作用前，本实验进一步使用GLP-1R特异性抑制剂Exendin-9-39(5 μmol·L-1)和AKT特异性抑制剂MK-2206(3 μmol·L-1)预处理EPCs。如Fig 5所示，Exendin-9-39和AKT特异性抑制剂MK-2206预处理可逆转Exendin-4促磷酸化效应(Fig 5，P<0.05或P<0.01)。这些结果提示，Exendin-4可能通过激活GLP-1R/AKT/eNOS信号转导通路发挥作用。

Fig 4 Representative photographs and quantification analysis of senescence of EPCs ( n=4 )**P<0.01 vs NDM-EPCs;##P<0.01 vs DM-EPCs

Fig 5 GLP-1R inhibitor Exendin-9-39 and AKT inhibitor MK-2206 inhibited Exendin-4 induced AKT and eNOS phosphorylation in DM-EPCs n=3 )1：NDM；2：DM；3：DM+Ex-4；4：DM+Ex-4+Ex(9-39)；5：DM+Ex-4+MK-2206.**P<0.01 vs NDM-EPCs;#P<0.05,##P<0.01 vs DM-EPCs;△P<0.05,△△P<0.01 vs DM+Exendin-4-EPCs

3 讨论

血管内皮损伤修复及血管生成能力障碍是糖尿病缺血性血管病变的重要发病环节，恢复和促进血管生成能力是防治糖尿病缺血性血管疾病的关键手段。骨髓来源的EPCs是促进血管内皮损伤修复及血管生成的重要因素之一，其数量和功能与糖尿病血管生成密切相关[8]。因此，积极寻求改善糖尿病EPCs功能和数量的有效手段是目前亟待解决的关键问题。

近年来，GLP-1和GLP-1R介导的途径已成为糖尿病治疗的潜在靶点。例如，GLP-1R分布于小鼠的心内膜、血管内皮、平滑肌细胞和心肌细胞中[9]。GLP-1/GLP-1R也被报道具有心血管保护作用和改善2型糖尿病患者内皮细胞功能障碍的潜力[10-11]。Exendin-4作为一种GLP-1R受体激动剂，具有较长的半衰期，能直接保护心血管系统而不受高血糖的影响，不仅能通过调节糖、脂代谢降低心血管疾病的风险，而且直接作用于血管内皮[12-13]。然而，Exendin-4在EPCs调控中的应用尚未见报道。在本研究中，我们发现Exendin-4可以促进糖尿病小鼠EPCs的增殖、迁移和黏附能力，同时抑制细胞衰老，由此提示Exendin-4的心血管保护作用部分可能是通过改善EPCs的功能活性实现的，但具体机制尚不明确。

既往研究表明，AKT/eNOS信号通路参与了EPCs的分化和缺血损伤[14-15]。高浓度葡萄糖通过调控AKT途径影响EPCs增殖、迁移和管腔形成能力[16]。eNOS是调节内源性NO生成的关键酶，受PI3K/AKT信号通路的调控[17]，因此，我们推测Exendin-4很有可能通过与GLP-1R受体结合，进而调控下游AKT/eNOS信号通路从而参与EPCs增殖、迁移、黏附和细胞衰老能力。为了进一步验证我们的假设，我们接下来检测了AKT/eNOS的磷酸化水平。结果显示，糖尿病小鼠EPCs AKT/eNOS磷酸化水平明显下降，Exendin-4处理可明显上调AKT/eNOS磷酸化水平，此外，GLP-1R抑制剂Exendin-9-39和AKT抑制剂MK-2206可阻断Exendin-4的促磷酸化效应，由此提示Exendin-4可能通过AKT/eNOS途径调控EPCs功能活性进而影响糖尿病血管内皮损伤修复及血管生成能力。

本研究也存在一定的局限性，首先仅在体外细胞实验观察了Exendin-4处理对糖尿病小鼠EPCs功能的影响，后续有待进一步通过动物实验及临床实验探讨Exendin-4对糖尿病EPCs功能活性的调控作用。其次，对于Exendin-4调控糖尿病EPCs功能活性的机制，仅检测了对AKT/eNOS信号通路的影响，但未进行进一步深入的探讨。

综上所述，本研究显示Exendin-4可调控糖尿病小鼠骨髓来源的EPCs功能活性，GLP-1R/AKT/eNOS信号通路可能参与了Exendin-4对糖尿病EPCs功能活性的调控。本研究为进一步发挥Exendin-4在糖尿病血管并发症的防治方面提供了新的理论依据。