抗疏健骨颗粒对去卵巢骨质疏松大鼠血清骨代谢及骨组织自噬水平的影响

王玥 刘启玲 徐守竹 田敏敏 张蓓 张荣强 孙娜 史传道

陕西中医药大学公共卫生学院，陕西 咸阳 712046

骨质疏松症(osteoporosis，OP)是一种以骨量、骨基质和骨小梁数量减少、骨组织微结构破坏而导致的以骨脆性增加为特征的全身代谢障碍性疾病[1]。其发病率高，病程长，常伴有严重并发症。据统计，70 %以上的病理性骨折由OP引起，进而增加死亡率(20 %～24 %)和致残率(40 %)，严重威胁人类健康[2]。目前，我国OP发病率高达7 %，预计到2050年我国OP和低骨量患者将增至3亿[3]。

骨骼处于骨形成与骨吸收的动态平衡中，当这种平衡被打破时，就可引起骨稳态失衡，最终发生OP[4]。骨稳态的维持需要成骨细胞(OB)、破骨细胞(OC)和骨细胞等多种细胞、激素、因子的密切配合[5]。绝经后，由于雌激素减少引起骨量丢失增加，骨生成减少，骨稳态被破坏。自噬是维持细胞稳态的重要机制[6]。有研究显示，自噬参与调节OP的病理过程，对维持骨稳态具有重要意义[7]。细胞中充当能量传感器的AMP依赖蛋白激酶(AMPK)可调节自噬水平[8]，其下游分子mTOR激酶是自噬过程中的关键分子，AMPK通过磷酸化mTORC1的调控元件或磷酸化TSC2蛋白两种途径抑制mTOR信号通路，故AMPK的活化，可抑制mTOR活性，进而解除mTOR对自噬的抑制作用，促进细胞活性，调节骨形成[9]。有研究[10]发现，抑制自噬相关蛋白Atg5后，OB的增殖和分化亦受到抑制。且敲除OB中Atg7，可降低骨自噬水平，引起内质网应激，ALP、Runx2等成骨分化标志物表达降低，骨基质矿化减少，细胞凋亡增加。以上研究均表明自噬有助于维持成骨细胞稳态。

目前，临床治疗OP的药物致癌、致畸、骨坏死等不良反应极大[11]。中药相对安全、不良反应少，且多种有效成分进行配伍后可多靶点调节。课题组前期通过4次临床研究发现，抗疏健骨颗粒可显著提高OP临床疗效[12-13]。本研究通过摘除大鼠双侧卵巢，复制绝经后OP模型，用不同剂量抗疏健骨颗粒进行干预后，检测成骨、破骨标志物及自噬相关蛋白，阐明抗疏健骨颗粒改善OP与调节自噬水平的关系。该机制的阐明对深入认识OP发生机理，临床运用抗疏健骨颗粒治疗OP提供实验依据。

1 材料和方法

1.1 动物及药物

60只雌性SPF级SD大鼠，3～4月龄，体重180～220 g，购于空军军医大学实验动物中心。实验动物合格证明：SCXK(陕)2019-001。本研究经陕西中医药大学伦理委员会批准。

抗疏健骨颗粒由陕西省中药基础与新药研究实验室制备，高温封瓶(1 g颗粒剂相当于10.15 g生药)，4 ℃保存备用，用时采用蒸馏水稀释成不同浓度用于实验。配方为：淫羊藿15 g、杜仲12 g、牛膝12 g、白术20 g、丹参10 g。

1.2 主要试剂

大鼠G蛋白偶联受体48(GPR48)ELISA试剂盒(BG公司)，大鼠转录激活因子4(ATF4)ELISA试剂盒(AMEKO公司)，ALP、BGP和TRACP试剂盒(Abcom 公司)，AMPK、LC3-II、Beclin-1和P62抗体(Pierce 公司)，β-actin抗体、DAB、BCA试剂盒和辣根酶标记二抗(上海如吉生物科技公司)。

1.3 主要仪器及设备

平行电泳仪(Eps 100，Tanon公司)，半干转仪(Tans-biot SD Cell，Bio-RAD)，凝胶成像系统(Universal Hood Ⅱ，Bio-RAD)，凝胶分析系统(GZS-2010，Tanon)，全波段酶标仪(M200 PRO，TECAN公司)，KHF-524组织切片机(德国莱卡公司)，DM4000B生物显微镜(日本Olympus公司)，自动恒温摊烤烘片机(GTK-2002、西安瑞丰)，制冰机(BL20，Barline)，石蜡切片机(RM2015，Leica)。

1.4 动物分组与骨质疏松模型的建立

60只大鼠适应性喂养1周后按体重随机分为5组(12只/组)，即假手术组、模型组、抗疏健骨颗粒低、中、高干预组。用10 %水合氯醛进行麻醉后，对大鼠进行双侧卵巢摘除术，复制绝经后骨质疏松模型。其中假手术组找到左右大网膜后，选取与双侧卵巢重量相近的大网膜进行切除，剩余处置完全与其他各组相同，1周后拆线。手术12周后，随机抽取模型组大鼠分离股骨，病理切片显示有骨质疏松症病理改变后，进行后续的药物干预研究。动物饲养为12 h明/12 h暗交替，(22±2) ℃常温正常饲养于笼中，自由饮食。

1.5 实验动物给药

参考《中药药理研究方法学》[14]，根据人和大鼠的计量折算系数确定所给药量。其中，假手术组和模型组给予蒸馏水灌胃；抗疏健骨颗粒三个剂量组分别为：低[0.287 g/(kg·d)]、中[0.573 g/(kg·d)]和高[1.146 g/(kg·d)]。每日清晨经口灌胃给药，6次/周，共12周。实验过程中每周称重调整灌胃剂量。

1.6 检测指标及方法

1.6.1组织形态学检测：随机选取假手术组、模型组大鼠6只，每只大鼠制作3张病理切片。具体为剔除大鼠右侧股骨肌肉及筋膜，保留骨膜。取股骨远端，置于10 %福尔马林固定液24 h，再将其置于10 %EDTA脱钙液，每日更换脱钙液，直至大头针可轻轻刺入，HE染色后，光镜下观察组织结构改变情况。

1.6.2血清学检测：给药12周后，各组动物禁食12 h，注射10 %水合氯醛(0.4 mL/100 g)进行麻醉，腹主动脉采血，4 ℃下1 500 r/min离心5 min，制备血清，采用ELLSA法按说明书规范检测骨钙素(BGP)、碱性磷酸酶(ALP)和抗酒石酸酸性磷酸酶(TRACP)水平。

1.6.3股骨破骨、成骨水平检测：采用ELLSA法，严格按照说明书测定骨组织中G蛋白偶联受体-48(GPR48)、转录激活因子4(ATF4)含量表达情况。

1.6.4自噬相关蛋白检测：用Western blotting法检测股骨中自噬上游分子AMPK、自噬相关蛋白LC3-Ⅱ、Beclin1和p62蛋白表达情况。取事先备好的股骨碎片200 mg，在含有液氮的研钵中充分研磨至粉末，小心收集骨粉末入匀浆管内，加入2 mL预冷裂解液(RIPA裂解液∶抑制剂∶PMSF=100∶1∶1)，待组织完全裂解后，匀浆两次，将匀浆液转至离心管，冰上沉淀30 min后离心 (3 000 r/min，25 min)。取匀浆上清液入EP管，其中吸出20 μL上清液用于BCA蛋白定量(BCA工作液A∶B=50∶1)，剩余部分加入Loading Buffer，100 ℃煮沸8 min后放至室温，转入-80 ℃冰箱用于WB测定。WB检测的具体步骤为：配胶→电泳→转膜→封闭→孵一抗→洗膜、孵二抗→洗膜、发光。具体条件：湿式电泳仪转膜300 mA、60 min；5 %脱脂牛奶室温下封闭1 h；Ⅰ抗和内参4 ℃孵育16 h；二抗(抗兔IgG)室温下孵育1 h，ECL显影。

1.7 统计学处理

2 结果

2.1 组织形态学检测

采用HE染色检测骨质疏松模型建立情况。假手术组骨髓腔较小，骨小梁数量较多且粗壮，形态结构完整，骨小梁有成骨细胞排列。模型组骨髓腔增大，骨小梁变细出现断裂，数量减少、结构紊乱且不完整，骨外膜少见骨原细胞。如图1。

图1 假手术组与模型组HE染色鉴定骨质疏松模型构建情况假手术组(×4)假手术组(×40)；模型组(×4) 模型组 (×40)Fig.1 Assessment the osteoporosis models of the ovariectomy in Sham and Model groups

2.2 各组大鼠血清中ALP含量比较

与假手术组相比，模型组血清ALP明显升高，差异有统计学意义(P<0.05)；三个用药组与模型组相比，ALP水平下降，差异有统计学意义(P<0.05)，其中，中剂量组ALP水平最低(P<0.05)，结果见表1。

表1 各组大鼠血清中ALP含量比较

2.3 各组大鼠血清中BGP、TRACP水平比较

与假手术组相比，模型组血清中BGP、TRACP水平明显升高，差异有统计学意义(P<0.05)；与模型组相比，抗疏健骨颗粒三个剂量组均可以降低血清中BGP、TRACP水平，差异有统计学意义(P<0.05)，而中剂量组对两个指标降低的平均值最小。结果见表2。

表2 各组大鼠血清BGP、TRACP水平的比较

2.4 各组大鼠股骨GPR48、ATF4含量比较

与假手术组相比，模型组骨组织中GPR48和ATF4均降低，差异有统计学意义(P<0.05)；与模型组相比，抗疏健骨颗粒三个剂量组均可以升高骨GPR48和ATF4含量，差异有统计学意义(P<0.05)，且GPR48高剂量组升高值最大，而ATF4低剂量组升高最多，结果见表3。

表3 各组大鼠骨组织GPR48、ATF4含量比较

2.5 各组骨组织AMPK蛋白的比较

与假手术组对比，模型组大鼠骨组织p-AMPK与t-AMPK比值下降，差异有统计学意义(P<0.05)；与模型组相比，低、中、高三个剂量组均可升高，差异有统计学意义(P<0.05)，结果如图2。mTOR上游蛋白AMPK表达状况，发现抗疏健骨颗粒可提高AMPK磷酸化水平(图4)，激活AMPK。

注：A 假手术组，B 模型组，C 低剂量治疗组，D 中剂量治疗组，E 高剂量治疗组。*P<0.05。图2 抗疏健骨颗粒对股骨AMPK的影响Fig.2 The effect of Kangshujiangu Granules on femoral AMPK

注：A 假手术组，B 模型组，C 低剂量治疗组，D 中剂量治疗组，E 高剂量治疗组。* P<0.05。图3 抗疏健骨颗粒对自噬相关蛋白的作用Fig.3 The effect of Kangshujian Granules on autophagy-related proteins in Femur tissues

2.6 各组骨组织自噬相关蛋白的比较

与假手术组对比，模型组大鼠骨组织LC3-Ⅱ、Beclin1的相对灰度值下降，P62相对灰度值升高，差异有统计学意义(P<0.05)；与模型组相比，低、中、高三个药物剂量组LC3-Ⅱ、Beclin1的相对灰度值升高，P62相对灰度值下降，差异有统计学意义(P<0.05)，结果如图3。

3 讨论

OP是骨形成与骨吸收的动态平衡被打破而发生。绝经后骨质疏松症是最常见的OP。自噬可调控骨骼稳态。一旦自噬异常，会导致受损分子和细胞器过度积累，诱发一些疾病，包括OP[15]。

目前，临床治疗OP的主要策略是降低骨吸收或促进骨形成，但使用的药物往往伴有明显的不良反应。如被广为使用的双膦酸盐类药物可出现非典型股骨头骨折和下颌骨坏死两种严重并发症[16]。雌激素和选择性雌激素受体调节剂可显著降低脊椎、非脊椎和髋部骨折，但可明显引起乳腺癌、冠状动脉和脑血管的血栓形成。因此，亟需寻找安全性高、疗效广泛的治疗OP的临床药物。中医学把骨质疏松归为“骨枯”、“骨痿”、“骨痹”范畴，认为肾虚是骨质疏松的主要病机，脾虚是骨质疏松的重要因素，血瘀是骨质疏松的加重或促进因素。现代中医药治疗OP，有单味中药、中药复方和针灸推拿等多种方式[17]。抗疏健骨颗粒是在总结临床经验方基础上，结合药学实验研发而成，主要功能是补肾健脾、活血壮骨。主要成分为淫羊藿、杜仲、牛膝、白术和丹参5味中药。

摘除卵巢法建立OP模型与成年女性OP临床症状高度相似，是公认的OP模型[20]。本研究中模型组股骨病理切片较假手术组骨髓腔变大，骨小梁变细并出现断裂，表明此动物模型建立成功。骨代谢标志物可体现骨形成与骨吸收之间骨代谢的特点与水平，是评估骨质量的关键指标。ALP升高是OP发生的重要指标[18]。本研究结果与以往研究一致，模型组ALP值升高，抗疏健骨颗粒三个用药组可降低ALP水平，从动物学角度证明抗疏健骨颗粒对改善OP具有一定作用。骨钙素(BGP)由成骨细胞(OB)分泌产生，反映OB活性，是骨形成的特异性指标。本研究显示，模型组BGP显著高于假手术组和抗疏健骨颗粒三个用药组，说明绝经后OP是高转换型，骨更新率快，且抗疏健骨颗粒可能通过改善OB功能，达到治疗OP的作用。血清中TRACP是骨吸收和破骨细胞活性的良好标志物，OP时往往升高[19]。本研究显示，模型组TRACP水平显著高于假手术组，三个用药组较模型组平均值有所降低，说明抗疏健骨颗粒可能作用于破骨细胞(OC)，但下降平均值仅为1.7 pg/L，是否具有现实临床意义尚有待进一步研究。

GPR48可调节下游信号ATF4基因的表达，ATF4在成骨细胞分化和发育过程中是一个关键的转录因子。ATF4缺陷鼠表现出科勒综合征(CLS)的骨骼表现型，即身材矮小、骨龄延迟、囟门闭合延迟、骨量减少、牙发育异常。成骨细胞蛋白合成能力下降，Ⅰ型胶原合成减少[20]。本研究结果显示，模型组GPR48和ATF4含量显著低于假手术组，而抗疏健骨颗粒三个剂量组均可升高GPR48和ATF4水平。说明抗疏健骨颗粒能够在一定程上改善GPR48和ATF4相关信号的转导过程，扭转OP引起的骨代谢失衡，也进一步证明中医补肾之法可以改变OP的内在生物学病理变化。

AMPK是一种进化上保守的丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，在分解代谢上调和合成代谢失活中起关键作用。活化的AMPK调节多种代谢过程，特别是自噬。故我们测定了股骨中AMPK及其下游的自噬相关蛋白水平，结果显示，与假手术组对比，模型组大鼠骨组织p-AMPK与t-AMPK比值下降，而抗疏健骨颗粒可升高这一比值，提示抗疏健骨颗粒可能通过调节AMPK，进而影响自噬，达到治疗OP的作用。这一提示通过测定股骨中自噬标志蛋白Beclin1、LC3-II和P62水平得到验证，结果显示，模型组大鼠股骨中的Beclin1和LC3-Ⅱ的相对灰度值较假手术组下降，而P62相对灰度值升高，差异均有统计学意义；而与模型组相比，低、中、高三个药物剂量组均可升高LC3-Ⅱ和Beclin1水平，降低P62含量，差异有统计学意义。这进一步证明抗疏健骨颗粒可通过调节自噬水平，改善OP症状。

综上，抗疏健骨颗粒可调节去卵巢骨质疏松大鼠血清及骨组织中骨代谢水平；增加AMPK磷酸化水平，加强AMPK对下游因子mTOR的抑制作用，使mTOR对自噬的抑制作用减轻，骨组织自噬水平增加，促进骨生成，进而调解骨稳态，这可能是抗疏健骨颗粒治疗OP的主要机制。