基于网络药理学和分子对接探讨补肾活血汤“从虚从瘀”治疗骨质疏松症的分子机制

岳志军 姜自伟 李紫阁 李绍烁 阮冠龙 王睿 赵京涛*

1.广州中医药大学第一临床医学院，广东 广州 510405 2.南京中医药大学无锡附属医院，江苏 无锡 214071

骨质疏松症是临床上的常见病，其特点以骨量降低、骨组织结构异常、导致骨脆性增加、继发骨折的危险性增加为特征的骨骼疾病[1]。由于人口老龄化, 骨质疏松症以及其导致的骨折发病率居高不下。西医治疗OP的药物常包括骨吸收抑制剂、骨形成促进剂、骨矿化药物以及新近报道的药物等[2]。但是西药治疗OP仍然有很多缺陷，常会出现服药后不良反应，不少抗OP药会导致患者不耐受，此外还有一些药物对于治疗OP的疗效不确切[3]。近年来，随着中医药自身的不断发展，保持自身内涵的同时结合现代科技，中医对骨质疏松症的研究日益增多，中医药理论治疗OP有效性的研究不断被挖掘，凸显中医治疗OP的优势，并取得了一定的成果[4]。

中医理论中无骨质疏松的病名，按照其症状及相关临床特点可以将其归纳于“骨痿”、“虚劳”、“骨痹”等范畴[5]。肝肾亏虚，筋脉不利是骨痿的基本病机[6]。肝肾不足会导致气滞血瘀，并且气滞血瘀也会导致肝肾亏虚，因此老年骨质疏松症患者通常具有肝肾不足兼气滞血瘀的特征。“补肾强筋，活血化瘀”是中医药治疗骨痿病症的重要原则，目前多数实验及临床研究已经证实[7-9]，补肾活血汤在促进骨折愈合、提高骨密度及改善骨代谢水平等方面疗效显著，但其内在成分众多，分子间作用关系十分复杂，致使其微观作用机制缺乏全面、系统的阐述，需要进一步探讨。

本研究将《伤科大全》里面的经典名方补肾活血汤[10-12]进行网络药理学和分子对接，挖掘补肾活血汤抗骨质疏松的关键靶点和通路，探索关键化合物与关键靶点的分子对接，揭示补肾活血汤“从虚从瘀”治疗OP的内在分子机理，为临床抗骨质疏松发挥中医药特色提供科学指导方案。

1 材料和方法

1.1 补肾活血汤化合物及靶点预测

通过TCMSP数据库分别对补肾活血汤中的中药“熟地”、“菟丝子”、“杜仲”、“枸杞”、“山萸肉”、“肉苁蓉”以及“当归”、“红花”、没药、“独活”进行检索，按ADME原则(口服利用度≥30 %，类药性≥0.18)[13-14]进行筛选，获得其化合物，并预测其对应靶点；根据Uniprot数据库，进行基因注释，规范对应靶点信息。对未检索到的中药“补骨脂”，分别从BATM-TCM数据库、化学数据库、TCMID数据库以及知网中查询相关化合物，然后通过PubChem数据库获取化合物的2D结构，导入Swiss ADME得到其SMILES，同样根据ADME原则进行筛选，对筛选出的化合物通过Swiss Target Prediction数据库进行预测，获取其对应靶点。

1.2 骨质疏松症的疾病靶点收集

以“osteoporosis”为关键词，分别从Gene Cards、OMIM数据库搜索相关的作用靶点，对收集到的疾病靶点进行整合、去重，预测出疾病相关靶点，获取相应的基因标准名。利用韦恩图在线制作网站Draw Venn Diagram，获取药物与靶点交集基因数目，绘制出韦恩图。

1.3 构建“中药-化合物-靶点-疾病”可视化网络

将中药、活性成分、靶点、疾病相关数据导入Cytoscape 3.7.2软件，使用“Network Analyzer”功能获得其拓扑学参数，构建“中药-化合物-靶点-疾病”网络，然后根据“Degree”值筛选出核心化合物。

1.4 蛋白互作网络(PPI)的构建

将1.3中获得的交集基因导入蛋白互作平台String数据库，导出其蛋白间相互作用数据至Cytoscape 3.7.2进行网络可视化分析，获得蛋白互作网络的拓扑学参数。

1.5 基因本体(GO)和京都基因与基因组百科全书(KEGG)分析

使用 R 软件及其后台数据库“org.Hs.eg.db”获取潜在作用靶点的基因 ID；再利用“DOSE”、“cluster Profiler”、“path view”程序包对这些潜在作用靶点进行 GO和KEGG富集分析；GO 功能富集分析包括三个方面的内容：生物学过程富集分析(biological process, BP)、细胞组成富集分析(cellular component, CC)、分子功能富集分析(molecular function, MF)，设定 p value Cutoff=0.05，q value Cutoff=0.05；将每一类按照显著性进行排序，把排在GO 功能富集分析前10和KEGG富集分析前30的富集条目通过柱状图和气泡图的形式进行可视化展示。

1.6 分子对接

为进一步明确补肾活血汤“从虚从瘀”治疗OP的内在分子机制，将1.3和1.4中筛选出的核心化合物和关键靶点进行分子对接。通过pubchem网站检索获取核心化合物的3D结构，下载SDF文件并利用Open Babel 2.3.2软件将SDF文件转化为PDB文件，从 Protein Data Bank数据库中检索获得受体，利用PYMOL 2.3.4软件对受体进行去水、去配体等操作，采用Autodock 4.2.6软件对受体进行加氢以及计算电荷处理，设置受体对接格点参数将小分子配体可能结合的活性口袋位点进行包含，并将受体和配体分别转化为pdbqt格式，利用Auto Dock Vina 1.1.2对受体与配体分别进行分子对接，对接后获取其构象。

2 结果

2.1 补肾活血汤活性成分筛选和对应靶点预测

在TCMSP数据库中共筛选出162种化合物，并预测出2 568个活性靶点，经整理去重获得146个对应靶点；补骨脂的化学成分共148个，得到9种活性化合物，预测出56个活性靶点，整理去重获得29个对应靶点。最终补肾活血汤共获得171种化合物，其中当归2个、熟地2个、独活9个、杜仲24个、枸杞40个、红花17个、没药43个、肉苁蓉6个、山茱萸17个、菟丝子10个、补骨脂9个，中药之间共有成分有11个，分别为beta-sitosterol、quercetin、stigmasterol、kaempferol、CLR、yangambin、beta-carotene、Mandenol、Ethyl linolenate、poriferast-5-en-3beta-ol、sitosterol。将补骨脂与其余10种中药的对应的靶点合并去除重复，共收集到166种活性靶点。

2.2 疾病靶点的搜集

通过Gene Cards、OMIM数据库检索到与“osteoporosis”相关靶标1 335个。将补肾活血汤与OP中的靶标取交集共获得54个交集基因，见图1。分别为PON1、JUN、NOS2、ESR1、AR、PPARG、PTGS2、CA2、PGR、SLC6A4、ESR2、NR3C1、DPP4、RXRA、NR3C2、TNFSF15、MMP1、SELE、VCAM1、CYP3A4、HMOX1、GSTM1、DRD2、ODC1、MMP2、IL6、MAPK1、CTSD、CCL2、IL1B、MPO、F3、SOD1、TP63、COL1A1、EGF、VEGFA、POR、COL3A1、RB1、IL-2、MMP3、CASP7、MMP13、MMP8、APP、CYCS、G6PD、EHHADH、CYP19A1、AKT1、HTR2A、HTR2C、ESRRA。

图1 补肾活血汤与OP的交集基因Fig.1 The intersection gene of Bushen Huoxue decoction and osteoporosis

2.3 “中药-成分-靶点-疾病”可视化网络分析

通过Cytoscape 3.7.2软件构建“中药-成分-靶点-疾病”可视化网络，将网络中各个节点及边的数据进行网络拓扑分析，如图2，其中红色代表疾病，蓝色代表中药，绿色代表靶点，紫色代表有效成分。共得到207个节点，其中包括疾病节点1个、中药节点11个、活性化合物节点141个、疾病与药物共有靶点54个和975条边。其中“Degree”和“Closeness”是对网络中节点重要性的描述，两者值越大，表示该节点越重要。以“Degree”值的中位数进行筛选，筛选出大于平均数的化合物作为核心化合物。共筛选出11个核心成分，其中前5个分别为槲皮素、木犀草素、山奈酚、β-谷甾醇、豆甾醇。表示以上成分可能为治疗OP的重要成分。

图2 “中药-成分-靶点-疾病”可视化网络Fig.2 “Chinese medicine-component-target-disease” visualization network

2.4 补肾活血汤治疗骨质疏松症的作用靶点蛋白互作网络

利用String数据库对药物与疾病共同作用的靶点进行分析，将分析结果导入Cytoscape 3.7.2进行PPI可视化网络构建，并对蛋白互作靶点前30的关键靶点展示，如图3～图4。其中节点表示蛋白质，边表示蛋白质之间的结合的关系。“Degree”值越大，表示该蛋白在网络中的重要性越大，图形越大，颜色越深；边越粗，颜色也越深，表示蛋白与蛋白相互作用关系越紧密。利用“Degree”值中位数逐步进行筛选，获取其核心靶点，共筛选到13个核心靶点蛋白，分别为AKT1、IL6、VEGFA、JUN、EGF、PTGS2、CCL2、MAPK1、IL1B、CYCS、MMP2、ESR1、PPARG。表明补肾活血汤通过多靶点发挥抗炎、免疫调节、血管形成等达到抗OP的作用。

图3 补肾活血汤治疗OP的蛋白互作网络Fig.3 The protein interaction network of Bushen Huoxue Decoction in the treatment of OP

图4 PPI网络中前30关键靶点柱状图Fig.4 Histogram of the top 30 key targets in the PPI network

2.5 GO和KEGG富集分析

利用R语言统计软件对富集结果使用柱状图和气泡图进行展示。GO功能富集分析共得到279个富集结果，其中BP、CC、MF分别有198、35、46个富集结果。对排名前10 的条目进行柱状图展示，如图5。其中BP中涉及最高的是营养水平、类固醇激素、腺体发育等，CC主要聚集于膜筏、膜微区、膜区等区域，MF主要集中在类固醇激素受体活性、内肽酶活性、核受体活性等，预测补肾活血汤主要通过以上生物学过程中发挥抗OP的作用。KEGG通路富集分析共有63个富集结果，并对其中前30条信号通路进行富集展示，其中 AGE-RAGR、TNF、IL17、HIF-1等信号通路可能与抗OP相关，表明补肾活血汤在抗炎、维持细胞内稳态和修复及再生损伤组织等方面发挥重要作用。如图6。

图5 GO功能富集分析Fig.5 GO function enrichment analysis

图6 KEGG通路富集分析Fig.6 KEGG pathway enrichment analysis

2.6 分子对接

为进一步明确补肾活血汤治疗OP的关键靶标与活性成分之间的结合效能，本研究选取排名前5的活性化合物与核心靶标进行分子对接，分子对接结合能打分及对接参数如表1所示，结合能越低，说明分子与靶点蛋白结合越稳定，分别取stigmasterol和MAPK1、stigmasterol和PPARG、beta-sitosterol和PPARG对接构象进行作图分析，如图7。表明补肾活血汤中的β-谷甾醇、豆甾醇主要与MAPK1和PPARG具有良好的结合力，能够充分发挥抗OP的作用。

表1 关键化合物与关键靶点分子对接结合能打分及对接参数Table 1 Docking and binding energy scores and docking parameters of key compounds and key target molecules

图7 补肾活血汤核心化合物治疗OP的3个核心靶点的对接结果Fig.7 Docking results of the three core targets of Bushen Huoxue Decoction in the treatment of OP

3 讨论

补肾活血汤具有补肾壮筋，活血止痛之功效，主治肝肾亏损，筋骨失养之骨痿。方中熟地、杜仲、菟丝子、补骨脂、枸杞子、山茱萸、肉苁蓉补益肝肾，填补精血，强壮筋骨；配以归尾、红花、独活、没药活血化瘀止痛，疏通筋脉，全方滋补肾精之中兼有化瘀之力。

本研究利用网络药理学和分子对接，探讨补肾活血汤治疗OP的分子机制。根据“中药-成分-靶点-疾病”网络显示的11个核心成分，大多具有抗炎、免疫调节、抗氧化等作用。β-谷甾醇和豆甾醇在抗氧化、抗高血脂、抗炎、免疫调节、抗肿瘤等方面表现出良好的药理作用[15-16]。槲皮素和山奈酚具有多种生物学活性，它具有抗氧化及清除自由基的作用，还具有抗炎、抗病毒、抗肿瘤、降糖等作用[17-18]。

通过构建蛋白互作网络，共显示13种治疗OP的核心靶点，其中VEGFA对于OP的发生起着重要作用，其作用于内皮细胞，能够增加毛细血管的通透性，促进局部血管的生成[19]。此外，VEGFA还能通过调控骨髓间充质干细胞发挥抗OP的作用。研究表明，VEGFA能够促进BMSCs的增殖和分化，同时还增加骨钙蛋白(BGP)和新生血管的数量[20]，预测VEGFA在骨骼血管化过程中与抗OP有关。而且在OP老鼠模型当中，补肾活血中药能够显著提高mRNA表达量，还能够显著提高VEGF蛋白表达水平，对肾虚血瘀骨代谢失常而导致的骨质疏松能够发挥抗OP的作用[21]。这可能与补肾活血汤“从虚”治疗骨质疏松关系密切，客观上达到“补肾壮骨”的目的。IL-6可以作用于成骨细胞，促使其分泌作用于机体，参与机体病理性骨量丢失的发生发展过程。研究发现，随着年龄的增长，骨质疏松的情况越突出，IL-6的水平也相应的增加[22]，表明IL-6与骨质疏松的严重程度呈正相关。动物性研究也表明，去卵巢大鼠表现为IL-6水平与大鼠腰椎、关节骨密度均呈明显负相关[23]。由此推论，补肾活血汤中活性成分通过调控IL-6发挥抗炎作用来改善骨质疏松的发生发展过程。

GO和KEGG结果显示，补肾活血汤通过多种生物学过程以及多信号通路参与治疗OP的过程。晚期糖基化终产物受体(RAGE)，是一种多配体受体，能够与多种配体相结合RAGE存在于许多类型细胞中，其参与了炎症消退、细胞内稳态的维持和损伤后的修复及再生等过程[24]。在骨质疏松过程中，RAGE的数量会明显上调，此外其还参与调节骨代谢过程[25]。研究发现，AGEs与sRAGE水平的升高与老年男性髋部骨折发生率的增加有关，并与骨质减少和骨质疏松的发生显著相关[26]。在成骨细胞中，AGE和RAGE的组合可激活Raf/MEK/ERK信号传导途径，降低成骨细胞活性并导致veslin-1和LC3B介导的自噬激活[27]。可以推测出补肾活血汤“从瘀”治疗骨质疏松与调节AGE-RAGE通路的关系密切。

根据成分靶点网络筛选出的核心成分与蛋白互作网络筛选出的靶点进行分子对接，stigmasterol和MAPK1、PPARG，beta-sitosterol和PPARG之间结合能分数最低，容易结合成稳定的构象。这表明这些成分与OP的治疗具有重要作用，可将这些成分用于探索治疗OP作为研究方向。本研究主要通过网络药理学和分子对接来阐述补肾活血汤抗OP的内在机制，未进行实验验证研究，需要进一步从实验角度探索本研究结果。

本研究利用网络药理学和分子对接技术，阐述补肾活血汤“从虚从瘀”治疗骨质疏松的活性成分、关键靶点和相互作用机制。补肾活血汤对骨质疏松的治疗体现了多靶点、多成分、多通路的作用特点，为阐述中医药理论提供了科学的解释，为进一步探讨补肾活血汤治疗OP奠定了基础。