灵芝孢子多糖的提取工艺优化及单糖组成、抗氧化活性分析

江和栋，牛 仙，万仁口，邓泽元，李红艳

（南昌大学 食品科学与技术国家重点实验室 南昌330047）

灵芝（Ganoderma lucidum）属担子菌纲多孔菌科，常作为一种珍贵的药用真菌[1]，中医学中一直视之为强身滋补的珍贵药材[2]。灵芝孢子（Ganoderma lucidum spores，GLS）是在灵芝生长成熟期从灵芝菌盖中弹射出来的极其微小的椭圆形生殖细胞，具有双层孢壁，为灵芝的精华部分。有效成分包括灵芝三萜、核苷酸、灵芝多糖、多肽，富含锌、钾、钙等微量元素[3]。灵芝孢子粉具有抑制肿瘤[4]，免疫调节[5]，清除自由基，抗衰老，降血糖，保肝护肝，提高机体耐缺氧能力[6]，保护神经系统及心肌细胞等[7]，因而备受消费者的青睐。

多糖是动植物细胞壁的重要组成成分，由多个单糖分子脱水缩合形成的高分子碳水化合物，具有复杂的化学结构及丰富的生物活性[8]。现代药理研究表明灵芝孢子多糖 （Ganoderma lucidum spore polysaccharide，GLSP）在增强免疫，抗肿瘤，降血脂，降血糖，抗氧化，抗病毒，抗炎症等方面有非常好的疗效[9-12]。灵芝孢子多糖由多种单糖组成，不同单糖的比例和含量必然会导致多糖的结构差异，进而产生不同的药理活性，探索不同产地的灵芝孢子多糖的单糖组成及含量对于评价和开发利用灵芝孢子具有重要意义。通常多糖需要通过酸的水解断裂其糖苷键，再通过色谱检测分析水解后的单糖，常用检测方法主要有HPLC[13-14]、TLC[15]、GC[16]、HPAEC-AED[17]等方法。目前，尚未发现GC-MS 法检测灵芝孢子多糖单糖组成的相关报道，与HPLC 相比，GC 分析的准确度、精密度、灵敏度和效率相对较高。

本研究拟采用单因素试验及响应面试验筛选出水浴法提取灵芝孢子多糖的最佳工艺参数，并对单糖组成做定性、定量以及抗氧化活性分析，为灵芝孢子产品的综合开发提供借鉴。

1 材料与方法

1.1 原料

7 种灵芝孢子粉，南昌同心紫巢生物科技有限公司，样品来源信息见表1。

1.2 试剂及仪器

葡萄糖、甘露糖、半乳糖、阿拉伯糖、木糖、鼠李糖等标品，阿拉丁；福林酚试剂，上海荔达生物科技有限公司；甲醇、乙醇、C4H8O2、CF3COOH、浓硫酸、苯酚、乙酸酐，西陇科学；DPPH（1，1-二苯基-2-三硝基苯肼），西亚试剂。

SHZ-A 水浴恒温振荡器，上海博讯；BioTek酶标仪，美国伯腾仪器有限公司；N-1100 旋转蒸发仪，上海爱朗；气相色谱-质谱联用仪，美国安捷伦公司；TDL-5-A 离心机，上海安亭科学仪器厂。

1.3 试验方法

1.3.1 灵芝孢子多糖提取工艺[18]预试验结果表明S1 灵芝孢子粉的多糖含量较高，故选择S1 灵芝孢子粉作为优化提取工艺的原料。取适量过80目筛的灵芝孢子粉，用95%乙醇浸泡24 h，脱去其中的脂类和低聚糖，离心（4 200 r/min，10 min）后60 ℃干燥。取适量脱脂孢子粉90 ℃热水浴提取2次，离心（4 200 r/min，10 min）并取上清液浓缩至原体积的1/4。将上清液用95%乙醇醇沉（4 ℃，12 h），离心（4 200 r/min，10 min），多糖以沉淀形式从水溶性糖溶液中分离出来，沉淀即为粗多糖。

1.3.2 多糖含量测定方法 采用苯酚-硫酸法测定[19]。灵芝孢子粉过80 目筛，准确称取经烘干至恒重的样品（干燥灵芝孢子粉）1 g，采用1.3.1 节的方法提取灵芝孢子粗多糖，将沉淀（粗多糖）用50 mL 容量瓶加水定容，此溶液为样品测定液。然后分别吸f取0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 mL 的100 mg/L的标准葡萄糖工作溶液至20 mL 具塞试管中，用蒸馏水补至1 mL，加入苯酚（5%）1 mL，快速补加硫酸5 mL（垂直于液面加入，勿接触试管壁），静置10 min 后振荡均匀，置于30 ℃水浴20 min，取适量反应液用酶标仪在波长490 nm 处测定吸光度，并计算提取率。

1.3.3 单因素试验 称取脱脂后干燥至恒重，过60 目筛的灵芝孢子粉末1 g，固定水浴振荡速率为100 r/min，温度为80 ℃的条件下提取，分别在10∶1，15∶1，20∶1，25∶1，30∶1 mL/g 液料比条件下提取1.5 h，考察液料比对灵芝孢子多糖提取率的影响。固定液料比20∶1（mL/g），分别在提取温度60，70，80，90，100 ℃条件下提取1.5 h，考察提取温度对灵芝孢子多糖提取率的影响。固定液料比20∶1（mL/g），提取温度80 ℃，分别提取1，1.5，2，2.5，3 h，考察提取时间对灵芝孢子多糖提取率的影响。

1.3.4 响应面设计试验 利用合Box-Behnken 原理设计试验，试验设计中的水平及编码见表2。采用Design-expert V 8.0 6 软件分析所得试验数据，优化水浴法提取灵芝孢子粉多糖的工艺条件。

1.3.5 单糖组成的GC-MS 分析

表1 7 种灵芝孢子粉样品来源信息Table 1 7 batches of Ganoderma lucidum spore powder sample source information

表2 Box-Behnken 设计因素及水平表Table 2 Box-Behnken design factors and level table

1.3.5.1 多糖水解[20-21]准确称取10 mg 灵芝孢子粉粗多糖，置于10 mL 比色管中，加入2 mL 2 mol/L 的三氟乙酸（TFA）溶液，氮封后于110 ℃水解5 h，冷却后氮气吹干得到水解产物。而后称取单糖标准品以及多糖水解物各10 mg，分别加入10 mg 盐酸羟胺和0.5 mL 吡啶，放入90 ℃水浴中振荡30 min。冷却至室温后加入0.5 mL 乙酸酐，在90 ℃下继续反应30 min，所得反应液经0.45 μm 有机滤膜过滤后做气相色谱分析。

1.3.5.2 色谱检测条件 色谱柱：Agilent HP-5毛细管柱；检测器：FID 检测器；载气：高纯氮，流速1 mL/min，分流比20：1。气化室温度250 ℃；检测器温度250 ℃；程序升温：160 ℃保持2 min，然后以2 ℃/min 升至240 ℃，240 ℃保持5 min；进样量1 μL。

1.3.6 灵芝孢子多糖抗氧化特性分析[10，22-23]

1.3.6.1 DPPH 法测定自由基清除能力 取100 μL 多糖溶液 （1 mg/mL） 或空白溶液与100 μL DPPH 甲醇溶液（0.065 mmol/L）混合，加入96 孔板中，缓慢摇匀，将溶液在室温条件下避光反应30 min，在波长517 nm 处测定其吸光值。将Trolox作为参照标准，结果表示为mmol/L Trolox/g DW。平行测定3 次，取平均值。

1.3.6.2 ABTS 法测定自由基清除能力 ABTS 工作液的配制：取88 μL 140 mmol/L K2S2O8与5 mL 7.0 mmol/L ABTS 储备液混匀，静置12～16 h。

用ABTS 工作液加80%甲醇混合稀释使之在波长734 nm 处吸光值为0.7±0.02，取200 μL ABTS 溶液和20 μL 多糖溶液（1 mg/mL）样品或标品溶液分别加入96 孔板中，将溶液在室温下避光反应6 min，于波长734 nm 处用酶标仪测定吸光值。将Trolox 作为参照标准，结果表示为mmol/L Trolox/g DW。平行测定3 次，取平均值。

1.3.6.3 Fe3+还原力（FRAP）测定 按照FRAP 试剂盒说明书配制FRAP 工作液，依次将180 μL 预热 至37 ℃的FRAP 工作液、10 μL 多糖溶液（1 mg/mL）或抗坏血酸标品溶液加入96 孔板，在振荡器上避光摇匀，37 ℃下反应5 min，于595 nm 波长处用酶标仪测定其吸光度值。以FeSO4系列标准溶液制作标准曲线，将FeSO4作为参照标准，结果表示为mmol/L FeSO4/g DW。平行测定3 次，取平均值。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

2.1.1 液料比对灵芝孢子多糖提取得率的影响由图1可知，随着液料比的升高，提取率呈上升趋势，并于20∶1（mL/g）时达到峰值，之后液料比继续增加，提取率趋于平稳。随着液料比增大，得率也相应增加，然而液料比过大，不仅延长了浓缩时间，而且会加大多糖的损失，反而导致得率下降[24-25]。因此最佳液料比为20∶1（mL/g）。

2.1.2 提取温度对灵芝孢子多糖提取得率的影响由图2可知，随着提取温度升高，提取率迅速提高，在80 ℃时达到峰值，之后随着提取温度升高，提取率趋于稳定并略有下降。提取温度升高伴随着多糖分子的剧烈运动，并加快多糖的溶出，因此升高提取温度有利于增加提取率。然而随着提取温度升高到80 ℃后，不仅会加快提取液的损耗，而且高温可能会破坏多糖结构，从而导致生物活性被损伤[26-27]。综上所述，选择80 ℃为最佳提取温度。

2.1.3 提取时间对灵芝孢子多糖提取得率的影响由图3可知，提取率随着提取时间的延长而增加，当提取时间为1～2 h 时，提取率显著增加，并在2 h 达到峰值，之后提取率趋于平缓。因此，最佳提取时间被确定为2 h。

图1 液料比对灵芝孢子多糖提取率的影响Fig.1 Effect of liquid-material ratio on the extraction yield of GLSP

图2 提取温度对灵芝孢子多糖提取率的影响Fig.2 Effect of extraction temperature on the extraction yield of GLSP

图3 提取时间对灵芝孢子多糖提取率的影响Fig.3 Effect of extraction time on the extraction yield of GLSP

2.2 响应面试验结果

2.2.1 Box-Behnken 试验设计结果 根据单因素试验结果运用Box-Behnken 进行3 因素3 水平的响应面试验[28]，结果见表3。

表3 响应面试验设计及结果Table 3 Response surface test design and results

根据试验结果分析，3 因素经过拟合得到的回归方程：

Y=1.54+0.090A+0.045B+0.075C-0.035AB+0.045AC-0.030BC-0.19A2-0.13B2-0.12C2

方差分析结果见表4，可以根据显着性水平（P 值）判断回归方程中各种因素及其组合对响应值影响的显著性，小于0.01 可认为其极显著，小于0.05 时认为其显著。结果显示模型P 值=0.0001＜0.01，表明该回归模型极显著，因变量和自变量的线性关系显著（R2=0.9737）。失拟误差=0.525＞0.05 则失拟不显著。模型的调整确定系数（R2Adj）=0.9400，说明模型和实际试验的拟合程度较好，试验误差较小，说明上述回归方程可代替试验真实点，对试验结果进行分析和预测。证明利用提取温度、液料比、提取时间作为单因素建立水浴法提取灵芝孢子多糖的工艺优化模型，可以提高灵芝孢子多糖的提取率。

表4 拟合二次多项式模型的方差分析Table 4 Analysis of variance of the fitted quadratic polynomial model

2.2.2 响应面分析 根据上述模型，通过二次回归方程得到的响应面如图4所示。响应面图的曲面形状可以看出影响因素的显著水平，曲面较陡说明影响显著，曲面较圆说明影响不显著[29]。

图4 液料比和提取温度（a）、提取时间和液料比（b）、提取时间和提取温度（c）3 因素交互作用响应曲面和等高线图Fig.4 Response surface and contour plots for the interactive effects on the yield of GLSP

由图4a 可知，当提取时间不变时，提取温度和液料比两者交互曲面较陡和等高线偏圆形，表现为不显著，灵芝孢子多糖得率的变化随着液料比的变化大于提取温度的变化，因此受液料比的影响较大；由图4b 可知，液料比和提取时间曲面较平缓，交互作用表现为不显著，因此受料液比的影响较大；由图4c 可知，提取时间和液料比之间曲面较平缓，交互作用表现为不显著，因此受提取时间的影响较大。试验因素中对灵芝孢子多糖提取得率的影响，依次为液料比、提取时间和提取温度，与表4结果一致。经软件处理，灵芝孢子多糖最佳提取工艺为提取温度80.5 ℃，液料比18.92∶1，提取时间2.18 h，在此提取条件下多糖的最大提取得率为1.564%。

2.2.3 验证试验 工艺参数修正为：液料比19∶1，提取温度81 ℃，提取时间2 h，做3 组平行试验，所得多糖提取率的平均值为（1.507±0.028）%，与回归方程所得的多糖提取率1.564%，相对误差仅为3.64%。说明回归方程能较真实地反应各因素对灵芝孢子多糖提取率的影响，证明用响应面法优化灵芝孢子多糖提取率回归模型可靠。

2.3 灵芝孢子多糖的单糖组成分析

2.3.1 灵芝孢子多糖色谱分析结果 采用盐酸羟胺肟化和乙酸酐乙酰化衍生法可获得单一的色谱峰，提高了气相色谱定性和定量分析的精确度[16]。通过GC-MS 对灵芝孢子多糖水解衍生物进行检测，得到图5，可知7 种灵芝孢子多糖主要由半乳糖、甘露糖、鼠李糖、葡萄糖、阿拉伯糖和木糖组成，结果与黄晓兰等[30]研究结果一致，然而7 个样品峰高低不完全相同，表明由于品种不同，各单糖含量有所差异。

2.3.2 线性关系考察 以单糖浓度为横坐标（x）、峰面积为纵坐标（y），对半乳糖、甘露糖、鼠李糖、葡萄糖、阿拉伯糖和木糖6 种单糖进行线性回归分析，结果见表5，相关系数均在0.9993 以上，线性关系较好。

图5 样品多糖组总离子流图Fig.5 Total ion chromatogram of sample polysaccharide group

表5 各种单糖的线性回归方程及线性范围Table 5 Linear regression equations and linear ranges of various monosaccharides

表6 不同来源灵芝多糖的单糖组成及含量（mg/100 mg）Table 6 Monosaccharide composition and content of Ganoderma lucidum spore powder from different sources （mg/100 mg）

表7 不同来源灵芝孢子粉的单糖摩尔比Table 7 Monosaccharide molar ratio of Ganoderma lucidum spore powder from different sources

2.3.3 单糖组成分析结果 不同来源灵芝孢子样品多糖的单糖组成及含量如表6所示，结果显示，不同来源的样品间各单糖的绝对含量差异达到显著水平（P＜0.05），葡萄糖是灵芝孢子多糖的主要组成单糖，不同来源样品葡萄糖绝对含量为8.854～13.243 mg/100 mg，其中来自吉林S7 样品中葡萄糖绝对峰面积最低，为8.854 mg/100 mg，来自江西的S3 样品中葡萄糖绝对峰面积最高，为13.243 mg/100 mg，后者是前者的1.495 倍。鼠李糖是灵芝孢子多糖中含量最少的单糖，不同来源样品间鼠李糖绝对含量为0.953～1.025 mg/100 mg，其中来自江西的S3 样品中鼠李糖绝对含量最低，为0.953 mg/100 mg，来自江西的S1 最高，为1.025 mg/100 mg，两者相差很小。张芝华[31]发现不同品牌灵芝孢子粉多糖的单糖组成较为接近，主要由半乳糖、葡萄糖、甘露糖组成，然而3 种单糖的比例相差较大，与本试验研究结果一致，其单糖含量差别较大的原因可能是由于试验所用原料的品种、区域、提取方法及测定方法存在差异导致。除此之外相同产地不同批次的灵芝孢子样品多糖的单糖组成也具有显著差异，如来自江西的S1、S3、S6，安徽的S4、S5 和吉林的S2、S7。此结果与陈体强等[32]的研究结果一致：不同采收期（早季、晚季和次年生）硬孔灵芝在多糖组成（单糖组成种类及其摩尔比）上存在一定的差异。这可能是由于不同收获期的气候差异对灵芝生长起到了一定的影响，进而影响其质量。因此灵芝的选种不仅要针对灵芝生长产地，同样也要对灵芝收获批次进行严格控制，才能获得优质菌种。

灵芝孢子单糖摩尔比如表7所示，鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖、半乳糖6 种单糖在7 个灵芝孢子样品中的摩尔比（相对含量）有略微的差别，其平均摩尔比为3.860，9.829，11.044，22.078，40.338，14.273。其中，甘露糖、葡萄糖、半乳糖为主要单糖，鼠李糖、阿拉伯糖、木糖为微量单糖。

2.4 灵芝孢子多糖抗氧化活性比较

图6 灵芝孢子多糖的抗氧化活性Fig.6 Antioxidant activity of GLSP

将灵芝孢子粗多糖配制成1 mg/mL 的溶液，分别测定FRAP 还原能力、DPPH 清除能力、ABTS清除能力，灵芝孢子多糖呈现出一定的抗氧化活性，且不同来源多糖之间有显著性差异（P＜0.05），见图6。从图中可以看出，灵芝孢子粗多糖具有一定的ABTS 清除能力和FRAP 还原能力，其中S2具有最高的ABTS 清除能力和FRAP 还原能力，S1 表现的抗氧化活性最低。结果表明灵芝孢子多糖的ABTS 清除能力要弱于DPPH 清除能力。可见，7 种灵芝孢子多糖的抗氧化性能不完全相同，总体表现为S2＞S3＞S5＞S4＞S6＞S7＞S1。

3 结论

以灵芝孢子粉为原料，以多糖提取得率为评价指标，通过响应面试验优化了水浴法提取灵芝孢子多糖工艺，利用Design-Expert 8.0 软件分析试验结果得到最佳工艺：提取温度81 ℃，液料比19∶1，提取时间2 h，在此条件下所得多糖提取率的平均值为（1.507±0.028）%。通过上述最佳工艺提取7 种灵芝孢子粉多糖，采用GC-MS 技术对其单糖组成做进一步分析，结果表明，鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖为灵芝孢子多糖的主要组成单糖，其平均摩尔比为3.860，9.829，11.044，22.078，40.338，14.273。来自江西、安徽、吉林的7 种灵芝孢子多糖的单糖组成具有较大差异，抗氧化活性也有显著差异。本研究可为进一步开发和利用灵芝孢子多糖提供参考依据。