肉类食品生物膜的形成机制及预防措施

孙孟娇，王稳航*

（1 天津科技大学新农村发展研究院 天津300457 2 天津科技大学食品科学与工程学院 天津300457）

肉和肉制品营养丰富，含有大量的蛋白质、脂肪、维生素、矿物质以及一些微量元素。是人体良好的蛋白质、必需氨基酸的营养来源[1]，同时也为微生物的生长提供了丰富的营养物质。在肉类食品加工及贮藏过程中，通常会因加工环境及设备污染物污染，加工操作不当，包装容器和材料污染及贮藏条件的改变而引起细菌污染，细菌能够在肉制品表面形成生物膜，使肉类食品腐败变质。生物膜是1 种或多种细菌不可逆地附着在肉制品表面上，形成的具有三维结构的细菌膜样物的微生物群落。生物膜形成的动力学过程，主要包括初始可逆粘附、不可逆粘附、形成、成熟和分散等[2]。最近，关于肉类食品中的微生物生物膜引起研究者的广泛关注。肉类食品中的细菌可分为致病性细菌和腐败性细菌，在肉及肉制品表面形成生物膜的细菌种类也存在差异，在冷鲜肉中存在的病原性细菌主要是大肠杆菌，腐败性细菌主要是假单胞菌、不动杆菌等；在熟肉制品中存在的病原性细菌主要是芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌等，腐败性细菌主要是变形杆菌以及一些其它的微杆菌。目前，许多学者对细菌生物膜机制、影响因素，以及对杀菌剂的耐受性、生物和化学方法对生物膜抑制作用等进行深入研究，为肉类食品工业中新型生物膜控制策略的研究提供了借鉴[3-5]。针对以上研究现状，本文主要介绍肉类食品生物膜的发现、形成机制，致病菌和腐败菌的成膜特点，以及新型的生物膜抑制途径，总结近5年国内外的研究现状，以期为肉类食品生物膜的有效防治提供理论与应用支持。

1 生物膜的发现及定义

Costerton 等[6]基于对呼吸系统气管感染的细菌群体所引发相关性肺炎的研究结果，首先提出了“Biofilm”（细菌生物膜或微生物生物膜）这一专用名词，得到了国际学术界的认同，从此推动了细菌生物膜成为国内外研究热点。生物膜通常被定义为细菌附着于肉制品表面，建立的具有三维结构的微生物群落，它由多种微生物组成，原核细胞和真核细胞嵌入由微生物群落组成的胞外基质（Extracellular polymeric substance，EPS）中[7]。EPS主要由多糖、蛋白质、核酸和脂质构成，它们能维持生物膜的机械稳定性，介导其与表面的粘附，并形成粘合的三维聚合物网络，使其互连并瞬时固定生物膜细胞。各种细菌胞外基质组成成分差异明显。当多个粘附的细菌聚合成菌落基质后，群体感应系统（Quorum sensing，QS）开始启动，产生大量胞外基质，与细菌黏结形成微生物菌落。群体感应是细菌进行种内或种间信息交流的一种信号转导机制，能够调控细菌的各种生理生化功能。包括生物膜的形成以及毒力因子的产生等[8]。生物膜中水分含量可达97%，此外还含有细菌分泌的大分子多聚物、吸附的营养物质和代谢产物及细菌裂解产物，如蛋白质、多糖、DNA、RNA 和肽聚糖等[9]。对于微生物细胞来说，生物膜是一个庇护所，它可以改善恶劣环境和环境波动对微生物造成的影响，如各种杀菌方式、pH 值或氧气变化、抗菌剂的存在以及宿主对生物膜的反应等。

2 生物膜的形成机制

生物膜由复杂的细菌群落组成，大多数细菌不可逆地附着在肉制品表面。生物膜的形成是一个层递、动态的过程，各种不同的物理、化学、遗传、生物作用都参与生物膜的最终成熟。自然界中绝大多数细菌都是以生物膜形式存在的，只有极少数细菌以浮游形式存在。

肉制品表面的细菌生长和生物膜形成可以分为5 步：可逆粘附阶段、不可逆粘附阶段、早期生物膜形成阶段、生物膜成熟阶段和生物膜分散阶段[10]。

2.1 可逆粘附阶段

生物膜形成始于浮游细菌附着于肉制品表面，通过范德华力、疏水相互作用和静电力在细菌和肉制品表面之间进行可逆粘附。细菌通过其表面附属物（如鞭毛、菌毛和细胞外聚合物等）可逆地粘附在肉制品表面[11]。

2.2 产生群体感应系统和EPS，进入不可逆粘附阶段

随着微生物细胞的繁殖，产生以多糖和蛋白质为主要成分的EPS，EPS 使生物膜更牢固地附着，并以不可逆的方式固定在肉制品表面。

2.3 早期生物膜形成阶段

细菌细胞紧密生长，开始向周围环境分泌聚合物基质，并进一步变成离散的细胞群体，形成早期生物膜。

2.4 生物膜成熟阶段

小菌落聚集成大菌落，形成完全成熟的生物膜结构。

2.5 生物膜脱落分散阶段

成熟的生物膜细胞脱落分散成浮游细胞或形成新的生物膜。

生物膜的实际形成机制尚不明确，未来几年依旧是科学研究的热点问题，然而生物膜的组成及其作用机制与微生物的抗性和毒力密切相关[10]。

图1 生物膜的形成过程[5]Fig.1 Process of biofilm formation[5]

3 肉类食品加工及贮藏过程中的生物膜形成

近年来，细菌生物膜引起了食品界的广泛关注。据估计，80%的微生物感染与生物膜有关[12]，微生物能够在许多食品工业领域形成生物膜，如肉制品加工、乳制品加工、新鲜农产品加工、家禽加工和酿造业等。尤其是肉类食品，由于生产链条长，环节多，不能完全封闭式、自动化生产，更加重了微生物污染的可能，导致严重的卫生问题以及由于食物腐败导致的经济损失。

肉类食品中的主要病原性细菌包括沙门氏菌属、单核细胞增生李斯特菌、金黄色葡萄球菌、出血性大肠杆菌O157：H7 和嗜热性空肠弯曲杆菌等[13]；主要腐败菌包括乳酸杆菌、假单胞菌、不动杆菌、热杀索丝菌、莫拉氏菌、明串珠菌和变形杆菌等[14]。在冷鲜肉中所存在的病原性细菌主要是大肠杆菌，腐败性细菌主要是假单胞菌、不动杆菌等[15]；在熟肉制品中存在的病原性细菌主要是芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌等，腐败性细菌主要是变形杆菌以及一些其它的微杆菌。不同肉类食品中存在的细菌种类如表1所示。

表1 不同肉类食品污染的细菌种类Table 1 The bacterial species in different meat and meat products

3.1 病原性细菌

3.1.1 沙门氏菌 沙门氏菌（Salmonella.spp）是革兰氏阴性棒状杆菌，在肉类、家禽和蛋制品等动物源性食品中最为常见，约占50%～75%。沙门氏菌具有附着、定植以及在各种食品和食品接触面上形成生物膜的能力，从而有助于增强其在宿主和非宿主环境中的抗性和持久性[38]。现在人们普遍认为，像沙门氏菌这样的食源性病原体可能主要以生物膜的形式，在固体表面生长，它们大多数的生长环境是在自然环境和食品工业环境中，而不是浮游环境[39]。沙门氏菌等食源性病原体的生物膜广泛存在于各种食品加工场所，包括鱼类加工、家禽、乳制品和即食食品等。形成的生物膜很可能造成持久性的污染，破坏食品安全，危害人类健康[40]。阐明调节肠道沙门氏菌生物膜形成过程的环境信号网络已成为近几年的研究热点[38]。沙门氏菌形成的生物膜可以抵抗环境压力和杀菌剂等，在食品工业中很难清除，目前有关沙门氏菌生物膜的控制主要集中在一些存在于标准实验室生长条件下的沙门氏菌生物膜，有关在肉类加工环境中去除生长在肉类食品中的沙门氏菌生物膜的研究较少[41]。因此需要研究新型、高效的方法来抑制肉类食品中沙门氏菌生物膜的形成。

3.1.2 单核细胞增生李斯特菌 单核细胞增生李斯特菌（Listeria monocytogenes）能够引起李斯特菌病，这是一种能威胁孕妇、新生儿、老年人等免疫功能低下者生命的疾病[42]。单核增生李斯特菌在自然界中广泛分布且能够在低温下存活，在4℃条件下3 h 内便可附着在肉制品表面，24 h 后能够形成稀疏集群的生物膜。研究表明，单核增生李斯特菌可以与革兰氏阴性菌或革兰氏阳性菌一起形成混合菌种生物膜，物种间的相互作用，使单核增生李斯特菌生物膜的形成以及对抑菌剂的抗性高度依赖于环境和细菌种类[43]。单核细胞增生李斯特菌在食品中广泛存在，并且李斯特菌对干燥、紫外线、辐照和杀菌剂具有持久的抵抗性，因此肉制品及肉制品生产设备中李斯特菌形成的生物膜需要持续控制。由此看来，更好地了解李斯特菌的特性、环境影响因素以及毒性因子与宿主易感性的相互作用，对于更好地控制李斯特菌生物膜的发生是有必要的。

3.1.3 金黄色葡萄球菌 金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）是一种适应性很强的微生物，可以以生物膜的形式生活在各种食品环境中。除了能够抵抗外界不利环境外，生物膜的产生也被认为是葡萄球菌属细菌的重要毒性因子，不慎食用后可出现恶心、剧烈呕吐、腹泻等食物中毒症状[44-45]。对于食品工业而言，重要的是要确定金黄色葡萄球菌在食品加工方面能够生存和繁殖的条件。迄今为止，与食物相关的金黄色葡萄球菌菌株形成生物膜的文献仍然很少，而且缺乏将食品暴露于模拟加工环境时，从食品、食品加工环境或形成生物膜的食品中分离金黄色葡萄球菌的能力。为了控制食品工业中的金黄色葡萄球菌形成的生物膜，需要更好地理解其与其它细菌及食品加工设备之间的相互作用。

3.1.4 大肠杆菌 大肠杆菌（Escherichia coli）是人和许多动物肠道中最主要且数量最多的1 种细菌，属兼性致病菌，大多数大肠杆菌在正常情况下不致病，少数大肠杆菌可引起疾病，如肠出血性大肠杆菌EHEC（O157：H7，O104：H4 等）。大肠杆菌具有附着在食品加工设备表面，形成单种和多种细菌生物膜的能力。Dutra 等[46]的研究结果表明，肉渣有利于多物种生物膜的发育，较高的温度有利于多物种生物膜的形成。从而证明由于肉类工业清洗过程不彻底，残留在设备表面的肉渣能够形成生物膜。Nair 等[47]研究硒对大肠杆菌EHEC胞外多糖合成的抑制作用，结果表明硒能够降低EHEC 浮游细胞的早期附着、生物膜的形成和EPS 的合成，证明硒可用于控制食品加工环境中EHEC 生物膜。研究控制大肠杆菌在肉类食品加工设备上形成生物膜的方法对提高肉类的安全性具有重要意义。

3.2 腐败性细菌

3.2.1 乳酸菌 乳酸菌（Lactic acid bacteria，LAB）是一类革兰氏阳性兼性厌氧菌，能利用乳糖或其它糖类转化为乳酸[48]。乳酸菌虽然在发酵食品中被广泛应用，但也是肉制品腐败的重要元凶。在厌氧环境中（由真空包装或在具有升高二氧化碳水平的气调包装产生） 低温肉类的微生物菌群以乳酸菌为主。它们通过产生令人厌恶的代谢产物而导致腐败，随后肉制品感官品质降低[49]。赵佳伟等[50]研究结果显示：Mn2＋、Fe3＋、Fe2＋、Mg2＋和Na＋在一定浓度下会对生物膜形成起到促进作用，Cu2＋、Cu＋、Al3＋、Ca2＋、Pb＋和Zn＋等金属离子则会对生物膜的形成起到抑制作用。所以，根据食品加工的不同需求，使用合适的方法抑制乳酸菌生物膜或促进乳酸菌生物膜成为近几年的热点问题。

3.2.2 假单胞菌 荧光假单胞菌（Pseudomonas fluorescens） 是冷却肉类最主要的腐败菌之一，具有较强的细菌生物膜能力，而且不同来源的荧光假单胞菌生物膜形成能力差别较大[36]。虽然假单胞菌是导致冷鲜肉腐败的最重要的细菌之一，但关于其生物膜形成的文章却鲜有报道。Liu 等[51]使用结晶紫染色和共聚焦激光扫描显微镜研究了假单胞菌生物膜形成特征，结果显示，假单胞菌在不同温度（30，10，4 ℃）下均能形成生物膜。菌株开始粘附在接触表面上后，在4～6 h 内便开始形成生物膜；在30 ℃下贮存12 h 后，生物膜开始大量形成，并且随着生物膜结构的发展，胞外多糖显著增加；在4 ℃和10 ℃下条件，即使细菌密度比在30℃下低，也能够形成更多的生物膜[51]。同时，假单胞菌已被证明能够在多种生物膜中为其它致病菌（如单核细胞增生李斯特菌等）提供庇护[52]。了解肉类食品中生物膜与食品腐败之间的关系有助于设计保护食品质量，抑制假单胞菌生物膜形成的策略。

4 控制措施及方法

在肉类工业中，细菌一旦找到合适的生存条件，便会附着在食品接触表面并形成生物膜。生物膜一旦形成，使用常规清洁和消毒方法可能无法完全消除它们。传统的冷冻、冷却、脱水以及热处理等方法，在提供安全的消毒肉类产品方面非常可靠，而其中一些会使产品的质量出现问题。可能会使肉制品的风味、香气和质地以及其它属性受到影响。为了改善这些品质属性，过去几年根据肉类食品的加工过程，探索了消除各类细菌生物膜的新策略。例如：结合几种杀菌方法或者开发新的高效的杀菌措施等，对消除生物膜及肉制品腐败的影响效果显著。

4.1 热力杀菌

热力杀菌是指利用加热的方法杀灭食品中特定的致病微生物。热力杀菌主要应用在熟肉制品加工过程。目前，蒸煮加热杀菌是生产加工食品最主要的杀菌技术之一，然而，蒸煮加热杀菌依赖于外部加热，使用热水或蒸汽作为传热介质，传热效率低，能量损失严重[53]。欧姆加热杀菌是1 种新兴的热处理技术，描述了当电流直接通过食物并以食物作为电阻产生热量的过程[54]。诸如欧姆加热杀菌等新型杀菌方法，具有加热速度块，能耗低，产品安全等优点，且肉制品的口味和质量等没有显著变化。Ito 等[53]对鸡肉进行欧姆加热杀菌和蒸煮加热杀菌做比较，结果表明，欧姆加热的鸡肉在无菌条件及35 ℃下可保存14 d，这意味着欧姆杀菌符合“食品卫生法”中规定的灭菌方法，因此，证明了欧姆灭菌方法可以提高食品的可靠性，延长食品的保质期。

4.2 非热力杀菌

非热杀菌技术是指利用非加热的方法杀灭食品中特定的微生物，使微生物的总量符合标准的杀菌技术，主要包括辐照杀菌、微波杀菌等，非热力杀菌的产热低或不产热，且能最大程度地保持食品的色、香、味和营养成分，有效地避免了传统热力杀菌技术对产品品质的影响，因而具有良好的应用前景，已成为抑制肉类食品细菌污染的常用方法之一[55]。虽然关于非热力杀菌抑制生物膜形成的研究相对较少，但仍旧是当前很有前景的灭菌方式。

4.2.1 辐照杀菌 食品辐照技术有3 种形式，即x-射线、电子束、γ-射线，是肉类食品杀菌常用的方法。辐照杀菌不仅能杀死肉制品表面的微生物，同时对于内部微生物的杀菌效果也比较明显，所以辐照杀菌在肉类食品加工中应用广泛。张艳艳等[56]研究辐照杀菌对酱卤牛肉品质的影响，结果显示剂量在6 kGy 的电子辐照可以使肉制品中微生物的总量控制在国家规定的范围内，不仅延长了肉制品的货架期，而且对品质几乎没有任何影响。王守经等[57]研究了γ-射线对牛肉品质的影响，发现其可以有效降低各种细菌的数量。在美国，辐照杀菌在几年前便广泛地应用于牛胴体的杀菌，以保证牛胴体和许多其它产品的安全性。然而，它在食品杀菌中的安全性仍然存在争议。

4.2.2 微波杀菌 微波和射频技术使用电磁波穿过食物，并使其分子振动产生热量。美国和日本等国家将微波杀菌广泛应用于肉类食品中[58]。李星等[59]研究微波杀菌条件对卤鹅贮藏期的影响，最终确定了杀菌温度94 ℃，杀菌时间9 min 时抑菌效果最好且在贮藏3 个月后菌落总数仍旧在国家标准范围之内。Barbosa-Cánovas 等[60]采用微波辅助热灭菌（MATS）和压力辅助热灭菌（PATS）技术对加工的肉类产品进行灭菌处理，热力杀菌与微波和压力结合，灭菌后能够提高肉制品的质量，延长货架期，证明将2 种或几种灭菌技术结合灭菌具有广阔的应用前景。

4.3 抑菌涂层

抑菌涂层在生肉加工和熟肉食品加工中广泛应用。在过去的几十年中，已经开发了广泛应用于食品中的抗菌化合物，用于抑菌涂层的释放。最古老且最常用的方法，包括通过简单浸渍、浸渍多孔材料或用所需抗菌化合物涂覆于肉制品表面。然而涂层缺乏特殊的粘合机制可能导致抗菌化合物快速释放。戴照琪等[61]以山苍子精油和肉桂精油制备涂层材料，研究其对干腌火腿的抑菌及抗氧化作用，结果表明，当山苍子精油和肉桂精油配比为1∶0.5～1∶2（质量比）、复合精油添加量为0.03%～0.05%时，复合精油涂层对火腿的脂质氧化、菌落总数及霉菌数均有较好的抑制作用。Nielsen 等[62]研究乳液包封的异丁香酚对单核细胞增生李斯特菌、金黄色葡萄球菌、荧光假单胞菌的生物膜的抗菌性质，结果表明：乳液包封增强了异丁香酚对生物膜的抗菌性能，说明防腐剂在抑菌涂层方面具有潜在的应用价值。诸多研究表明抗菌涂层已经成为抑制生物膜形成的一个非常活跃的研究领域。

4.4 活性包装

活性包装系统可以通过在独立装置（例如：小袋或垫）中或在包装材料中，掺入抗微生物试剂来构建，包装材料可以用酶、细菌素、天然提取物等进行功能化，起到与抗菌物质相同的抑菌功能[63]。抗菌活性包装有4 种基本类型：1） 将抗菌物质加入小袋或小垫中。抗微生物小袋或小垫可以原位产生抗菌化合物并立即释放，或通过使用小袋携带然后在肉制品表面直接释放抗菌剂以抑制生物膜[64]；2）将抗菌剂直接掺入包装膜中[63]。抗菌化合物从包装膜逐渐释放到包装顶部或食物表面，以抑制微生物的生长；3）用基质涂覆包装，以基质充当抗菌剂的载体；4）使用本身具有抗菌性的聚合物。例如：藻酸钙薄膜可以减少牛肉中大肠菌群等的生长，其抗菌机制可能是由于藻酸钙对细菌细胞的离子和毒性作用[65]。含有Nisin 的活性包装材料用于抑制在4 ℃条件下保藏的牛肉汉堡中乳酸菌的生长，延长其货架期[66]。活性包装技术不仅提高了肉类食品的质量、安全性和便利性，而且延长了肉类食品的货架期[67]。

4.5 纳米技术

随着纳米技术的兴起，开发纳米材料使新型抗菌剂成为可能，其在生肉加工和熟肉食品加工中不断得到应用。Siddiqi 等[68]已经证明，AgNPs 能够阻止许多细菌，如蜡状芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、伤寒沙门氏菌、铜绿假单胞菌、大肠杆菌、肺炎克雷伯菌、副溶血性弧菌和真菌白色念珠菌的生长和繁殖。研究表明AgNPs 已被应用于新鲜里脊肉的包装，以抑制或延缓细菌的增殖，延长货架期[69]。Applerot 等[70]研究ZnO 涂层抑制细菌定植的时间效应，结果表明，ZnO 涂层能够抑制大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的生物膜形成，且抑制效果能够持续10 d。定植在表面作为生物膜生长的细菌，通常比浮游状态下的细菌对抗菌剂的抗性更高。然而，纳米材料在与食品接触过程中，其在食品表面及内部的迁移及潜在的毒性仍未有定论，其安全性仍需进一步研究。

4.6 生物膜降解酶

酶法去除细菌生物膜已经在食品领域得到关注。生物膜是附着在食品表面且嵌入自身产生的胞外EPS 中，生物膜降解酶的作用目标主要是EPS，EPS 主要由多糖、蛋白质、核酸和脂质等组成。鉴于生物膜组成成分的不均匀性，因此需要不同类型的酶或者多种酶混合来消除肉类食品表面的生物膜。生物膜降解酶的作用机理是：1）直接攻击生物膜组分，并降解它们；2）诱导细胞裂解；3）干扰QS 系统；4）催化抗微生物剂的形成。酶的作用本质与生物膜的完整性降低有关，将基质分子降解，然后通过细胞进一步代谢成为单体[71]。有4种类型的酶对于生物膜去除效果显著：抗QS 酶、氧化酶、多糖降解酶和蛋白水解酶[72]。Wang 等[39]研究5 种经检测的生物酶（蛋白水解酶、中性蛋白酶II、纤维素酶、糖苷淀粉酶、枯草杆菌蛋白酶）对沙门氏菌成熟生物膜具有较强的去除能力，然而不锈钢表面仍存在大量残留的生物膜细胞，20 mg/mL 纤维素酶和1 mg/mL 十六烷基三甲基溴化铵（CTAB） 浸液联合处理比单一处理能更好地减少成熟生物膜，该联合方法可以彻底去除成熟的生物膜。

5 结语

在肉制品工业中，生物膜产生的影响巨大，对肉制品的生产过程和贮藏保存均可产生严重的危害。目前对肉类食品表面生物膜的形成机理研究已比较深入，对单一细菌生物膜的控制措施研究也较透彻，而对混合细菌形成生物膜的成膜机制和相关防控措施仍有待进一步解决，以达到彻底防治肉类食品生物膜感染的目的。研究方式也应由最初的单一或混合菌的模型，转变到实际肉类食品生产的各个环节，将生物膜形成过程的不同阶段，包括初始可逆粘附、不可逆粘附、形成、成熟和分散等一一细化，根据实际过程中生物膜形成的动力学过程，重点研究肉类食品工业中预防和控制生物膜的新方法，从而控制肉制品行业中细菌生物膜的形成。