葡萄果实酒石酸生物合成研究进展*

曹慧玲，舒河霖，邵建辉，张海明，马春花

（1 云南农业大学园林园艺学院，昆明 650201）（2 云南农业大学云南省高校葡萄与葡萄酒工程技术研究中心）

葡萄是世界上栽植最广泛的果树之一，有机酸是葡萄果实内在品质的重要组分之一，直接影响葡萄果实口感，并赋予葡萄酒理想的感官特性和抗氧化能力[1]。葡萄果实中有机酸主要包括酒石酸、苹果酸，以及少量的乳酸、乙酸、柠檬酸和琥珀酸等，它们的含量与组分是决定葡萄果实风味和品质的重要因素。其中酒石酸占有机酸含量的42.8%～77.0%，是葡萄浆果中的主要有机酸，决定了葡萄、葡萄酒的pH值和酸性[2]。此外，酒石酸在葡萄果实转熟过程中具有相对较好的代谢稳定性，不像苹果酸含量极易受环境高温、呼吸和糖异生作用影响而迅速下降[3]。由于酒石酸在葡萄果实和葡萄酒中具有重要意义，国内外学者对其进行了大量研究，并发现了一些与酒石酸生物合成相关的酶及基因，但葡萄果实酒石酸完整的生物合成途径尚不明确。因此，笔者综述了目前国内外葡萄果实酒石酸的相关研究，为今后进一步解析葡萄果实酒石酸的完整生物合成途径和调控机制提供参考。

1 酒石酸

1.1 酒石酸的来源及结构

酒石酸（Tartaric acid，TA），分子式C4H6O6，学名2,3-二羟基丁二酸，白色单体，有强酸味，易溶于水和乙醇，是一种二元羧酸[4]，最早在1769年由瑞典化学家卡尔·威廉·舍勒发现。起初因在葡萄酒酿造过程中的发酵罐壁上发现一种晶体，其形状像石头而被命名为酒石，后经研究发现其主要成分是酒石酸氢钾，在葡萄酒酿造过程中易沉淀，可以从酒石酸氢钾分离出酒石酸，因此，传统上的酒石酸是葡萄酒发酵过程中产生的固体副产品[5-6]。

酒石酸化学手性最先由Jean-Baptiste Biot[7]于1832年发现，根据旋光面性质的不同，分为2种对映异构体——L(+)-TA和D(−)-TA（图1）。自然界存在的酒石酸为L(+)-TA[8-9]，是葡萄属植物和天竺属植物中特有的酸，而在模式植物如拟南芥、番茄以及其他水果和经济作物中未见积累。D(-)-TA在天然来源中很少存在，通常被认为只由某些微生物种形成。

图1 L(+)-TA和D(−)-TA的费歇尔投影式

1.2 酒石酸在葡萄中的作用

酒石酸是葡萄果实和葡萄酒所特有的有机酸，因此又名葡萄酒酸。葡萄浆果中的酒石酸酸性较强，是葡萄、葡萄酒酸度的主要贡献者，在一定程度上决定了葡萄果实的酿酒品质；有机酸有助于抑制微生物繁殖，葡萄汁的pH值主要取决于浆果中的酒石酸含量，浆果中的酒石酸可以将葡萄酒的pH值维持在3.0～3.5，使葡萄酒颜色及其微生物保持稳定。此外，酒石酸含量影响葡萄果实风味的平衡，过高会影响果实的适口性，过低则果实平淡无味。酿酒师可以在葡萄酒酿造过程中，通过添加酒石酸，最大限度地减少氧化和微生物腐败，从而提高葡萄酒的感官特性和老化潜力；若酒石酸被某些细菌代谢，会使葡萄酒风味缺乏圆润感，导致泛浑病。

2 葡萄果实酒石酸的生物合成

早期的研究表明，酒石酸存在于葡萄叶片中，而其在葡萄浆果中的积累是由叶片合成运转而来，但Hale和Hardy在20世纪60年代初证明葡萄浆果本身就是合成酒石酸的场所[10]。Debolt等[11]使用抗坏血酸进行放射标记，也证明了酒石酸的合成主要发生在葡萄浆果中。Debolt等[11]发现酒石酸在葡萄花后1个月内大量积累，而Deluc等[12]研究表明酒石酸生物合成积累通常发生在浆果转色期前，之后几乎没有新的酒石酸合成。通常酒石酸在果实生长发育过程中逐渐积累，在转色之后浓度开始下降，成熟期酒石酸浓度下降主要是由于浆果体积增大导致酒石酸被稀释的结果[12]。在葡萄浆果成熟和随后的酿酒过程中，酒石酸不会通过呼吸作用被葡萄浆果细胞代谢，保持代谢稳定[13]。放射性同位素标记和示踪技术，揭示了葡萄果实中酒石酸的合成前体是抗坏血酸，在C4/C5位点裂解后逐步催化生成酒石酸[11,14-15]。目前，人们对这一途径知之甚少，也没有研究发现酒石酸参与各种初级代谢途径[16]，因此要探明酒石酸生物合成途径还需要进一步研究。

2.1 葡萄果实酒石酸生物合成途径

研究表明，葡萄酒石酸生物合成的主要前体物质是抗坏血酸（AsA）[14,17]，通常认为酒石酸合成途径中存在2个不同的阶段，即上游阶段和下游阶段（图2）。

图2 葡萄果实可能的酒石酸合成途径[18-19]

（1）上游阶段：合成酒石酸前体物质抗坏血酸。在植物中至少已经报道了4种抗坏血酸生物合成途径。现已知抗坏血酸生物合成的主要途径是基于光合作用的碳通量通过一系列酶催化反应的结果，由Wheeler等[20]在无碳链倒位和L-半乳糖酸-1,4-内酯是抗坏血酸合成的直接前体下提出，称为Smirnoff-Wheeler途径，即L-半乳糖途径。这条途径在葡萄浆果的生长阶段占主导地位[21]，其关键中间体是L-半乳糖（L-Gal），此途径涉及D-葡萄糖转化为GDP-D-甘露糖（GDP-D-Man）、GDP-L-半乳糖（GDP-L-Gal）、L-半乳糖、L-半乳糖酸-1,4-内酯（L-GalL）和抗坏血酸[22]。在此途径中，GDP-D-甘露糖通过GDP-甘露糖-3′,5′-差向异构酶（GME）催化生成GDP-L-半乳糖，GDP-L-半乳糖经GDP-L-半乳糖磷酸化酶（VTC2）催化生成L-半乳糖-1-P，再经L-半乳糖-1-P-磷酸化酶（VTC4）催化生成L-半乳糖[23]，之后L-半乳糖经过L-半乳糖酸脱氢酶（L-GalDH）脱氢生成抗坏血酸的直接前体L-半乳糖酸-1,4-内酯，接着被L-半乳糖酸-1,4-内酯脱氢酶（L-GLDH）催化生成抗坏血酸。该途径涉及的酶多数已被检测、纯化或克隆。

（2）下游阶段：合成酒石酸。结合研究者的发现和各产物的结构式，推断酒石酸生物合成是抗坏血酸经过水解和氧化转化为2-酮-L-古洛糖酸（2-KGA），接着可能被2-酮-L-古洛糖酸还原酶（2-KGR）还原为L-艾杜糖酸，然后L-艾杜糖酸被L-艾杜糖酸脱氢酶（L-IdnDH）氧化成5-酮-D-葡萄糖酸（5-KGA）。5-酮-D-葡萄糖酸在C4和C5之间裂解产生4碳的L-threo-tetruronate，接着被氧化形成酒石酸（图2、图3）。但植物体内酒石酸生物合成的途径及生物合成过程中的相关酶还需要进一步验证和证实。

图3 葡萄酒石酸生物合成途径中间产物结构式[24]

2.2 葡萄果实酒石酸生物合成途径相关酶及基因

目前，国内外对植物中抗坏血酸生物合成和代谢已有较多的研究[13,25-26]，关于L-半乳糖途径中涉及的大多数酶已被检测、纯化或克隆（表1）。其中GME、VTC2、L-GalDH等被认为是抗坏血酸生物合成阶段的关键酶，其酶活性和酶基因表达量对抗坏血酸含量的调控极其重要[15,27-29]。Tabata等[30]和安华明等[31]分别在烟草和刺梨中验证了L-GLDH的功能，最近，刘庆帅[32]的研究也证实了L-GLDH基因与黑穗醋栗果实抗坏血酸的积累显著相关，且品种间抗坏血酸含量的差异可能主要受L-GLDH调控。但目前葡萄果实从抗坏血酸到酒石酸生物合成途径中相关酶及基因的研究还较少[15]，在下游阶段，抗坏血酸经过氧化、还原反应最终合成酒石酸，可能涉及到一系列的水解酶、氧化酶、还原酶和裂解酶[33]，其相关研究取得了一定的进展。

表1 L-半乳糖途径关键酶基因的相关研究

2.2.1 L-艾杜糖酸脱氢酶（L-IdnDH）

L-艾杜糖酸脱氢酶催化L-艾杜糖酸氧化成5-酮-D-葡萄糖酸，迄今为止，它是在从抗坏血酸到酒石酸合成过程中被确定的酶之一，是在酒石酸合成途径中鉴定出的唯一基因，同时也是限速酶[14]。Debolt的酶学实验以及早期的14C同位素饲喂实验证实了艾杜糖酸脱氢酶所催化的反应是葡萄属植物中酒石酸生物合成的限速步骤[24]；Debolt等[14]通过对葡萄属25个品种的果实有机酸谱库分析，发现乌头叶蛇葡萄（Ampelopsis aconitifolia）不含酒石酸，且没有L-艾杜糖酸脱氢酶基因转录物；而且Wen等[41]也发现葡萄果实中VvIdnDH的转录水平和翻译水平与酒石酸含量的变化趋势相同，并且在成熟浆果中几乎没有检测到VvIdnDH转录，进一步推断葡萄成熟期可能不合成酒石酸；Ren等[42]通过CRISPR/Cas9系统，靶向编辑了L-艾杜糖酸脱氢酶基因，对‘霞多丽’葡萄悬浮细胞进行了遗传转化，转基因细胞团中酒石酸含量表现为降低的趋势，这表明L-IdnDH调控酒石酸的生物合成，证明L-IdnDH是葡萄酒石酸生物合成的关键酶。但也有研究者提出了不同的看法，Cholet等[15]认为L-IdnDH可能不是酒石酸生物合成途径中唯一的关键酶，该酶可能或多或少地与其他尚未鉴定的酶协同起作用，并且可能受气候条件影响较大。另外，天竺属植物酒石酸生物合成方式与葡萄不同，由抗坏血酸C2/C3的裂解形成L-苏糖酸后进一步形成酒石酸，Narnoliya等[19]对玫瑰香天竺葵酒石酸的研究中却检测到了葡萄L-IdnDH基因的表达，说明L-IdnDH基因可能在玫瑰香天竺葵酒石酸生物合成中起作用，天竺属植物酒石酸生物合成途径可能存在抗坏血酸C4/C5的裂解。

2.2.2 2-酮-L-古洛糖酸还原酶（2-KGR）

2-酮-L-古洛糖酸还原酶催化2-酮-L-古洛糖酸（2-KGA）还原为L-艾杜糖酸。许多微生物中已经报告了具有催化此化学反应能力的酶，但是其在植物中少见报道。大肠杆菌中2-KGR的酶学表征验证了其在大肠杆菌中可以将2-KGA还原为L-艾杜糖酸[33,43]，但Ford[44]认为该酶可能是乙醛酸还原酶（GR），其在足够的底物存在下可以充当羟基丙酮酸还原酶或2-KGR。Jia等[45]从葡萄中初步鉴定了一个具有2-酮-L-古洛糖酸还原酶活性的醛酮还原酶Vv2KGR，使用NADPH作为首选的辅酶，Vv2KGR可以有效地将2-酮-L-古洛糖酸（2-KGA或2KLG）还原为L-艾杜糖酸，这说明了Vv2KGR参与从抗坏血酸到酒石酸生物合成的过程。

2.2.3 Transketolase（TK）和Tartaric semialdehyde dehydrogenase（TSAD）酶

到目前为止，对推测催化5-KGA生成酒石酸半醛的TK以及催化酒石酸半醛生成酒石酸TSAD的研究甚少。Debolt[46]利用葡萄基因组数据初步筛选到TK和TSAD的候选基因。Debolt[46]从葡萄中分离出的重组TK能够使用5-keto gluconic acid和4-磷酸赤藓糖作为底物形成酒石酸半醛和6-磷酸果糖，但活性非常低；而且Ford[44]分离出的2个葡萄TK基因（vvTKI和vvTKII）在pET 14b表达中不具有转酮酶活性；Debolt提供的TSAD的候选基因编码了植物中琥珀酸半醛脱氢酶的同源基因，有可能将酒石酸半醛氧化为酒石酸，但迄今为止未有相关报道。目前TK和TSAD基因的表征和功能尚不明确，还需要进一步研究和证实。

2.3 葡萄果实酒石酸生物合成的调控

目前关于葡萄果实酒石酸生物合成积累及调控研究也取得了一些进展。葡萄不同属间果实酒石酸含量存在差异，比如葡萄属蛇葡萄科中乌头叶蛇葡萄天然缺乏酒石酸和L-艾杜糖酸脱氢酶基因转录物，且表现出极高水平的抗坏血酸水平[46]。同时，酒石酸在葡萄果实不同部位中含量不同，并且随着果实的发育和成熟，果皮和果肉外部中的酒石酸浓度降低，而果肉内部和种子附近区域的酒石酸浓度保持相对不变[47]；此外，Lamikanra等[48]在比较葡萄不同组织中有机酸含量研究发现，成熟期葡萄果实将近70%的有机酸分布在果皮，而种子含酸量却很少；Falchi等[49]应用高效液相色谱法对葡萄果肉、果皮和种子的成分进行分析，发现不同品种葡萄果实不同部位酒石酸的含量存在差异；赵悦等[50]研究发现，不同产地的‘赤霞珠’葡萄成熟果实果皮、果肉的酒石酸含量存在差异，果皮中酒石酸含量均高于果肉，这说明酒石酸的积累具有组织特异性。

此外，光照对葡萄酒石酸的生物合成起着重要作用。葡萄植株经高光和弱光处理后，酒石酸水平随着光照强度的增加而增加，L-艾杜糖酸脱氢酶基因的表达量也发生变化[46]。Debolt等[51]在葡萄花期用黑色塑料盒遮光以排除光线，同时保持环境温度在一定范围内，结果显示出每个浆果的酒石酸含量降低。研究表明一些植物生长调节剂对酒石酸的生物合成代谢具有重要调控作用。Ziliotto等[52]在花后65 d用NAA处理葡萄后立即观察到酒石酸的显著增加；葡萄花序与果穗经6-BA处理后，抑制了L-艾杜糖酸脱氢酶基因表达，对酒石酸含量产生了显著的抑制作用[53]；‘极早蜜’葡萄在花后60 d叶面喷施水杨酸可以抑制果实酒石酸的积累[54]。

这些研究结果表明，酒石酸在不同类型葡萄、葡萄果实不同部位的含量有差异，且一些外界条件（如光照、植物生长调节剂等）会影响酒石酸的生物合成，这对我们研究和验证葡萄果实酒石酸生物合成途径中未被证实的一些酶（如转酮醇酶、酒石酸半醛脱氢酶等）基因的功能提供了参考依据。

3 研究展望

全球气候变暖对葡萄果实品质有显著影响，葡萄果实中有机酸含量主要受温度影响。因为苹果酸在果实成熟过程中会因较高的温度降解，导致浆果酸度下降较快[55]，但浆果中酒石酸浓度对高温的敏感性远低于苹果酸浓度。浆果中酒石酸含量高的品种对气候变化不那么敏感，在浆果成熟期间，每个浆果中的酒石酸含量是相对稳定的[51]，因此酒石酸含量高的品种能更好地适应未来不断变化的气候条件。有些温暖地区的葡萄在酿酒过程中因其自然酸度不满足要求，酿酒师通常需要人工添加更多的酒石酸，导致酿酒成本过高[56]。所以研究影响葡萄果实酒石酸含量的因素，探明酒石酸在葡萄中的生物合成规律以及如何对葡萄果实的酒石酸积累进行有效调控将成为今后的研究热点。

因此，围绕以下2个方面的深入探讨可能是未来葡萄酒石酸研究领域的主要方向：①目前葡萄果实酒石酸生物合成途径中的酶尚未被完全证实，其生物合成主要关键酶基因的克隆、功能鉴定、遗传转化等还有待研究。尤其是TK基因的表征和功能尚不明确，还需要进一步研究和证实；②葡萄果实酒石酸积累是一个复杂的生物学过程，目前关于葡萄果实酒石酸含量的调控因素研究以光照、植物生长调节剂处理为主，其他胁迫因素如高（低）温、干旱或水涝等生物胁迫或非生物胁迫对酒石酸合成的影响研究较少，这都需要进一步研究。