碱性氨基酸-PAF26衍生多肽的抗菌性能研究

曹凤仪，马港庆，秦 琦，梅 林，朱根兴

(中原工学院材料与化工学院，河南 郑州 450007)

当有害微生物入侵人体时，会在人体内繁殖并导致感染性疾病如肺炎、肠炎、骨髓炎、脑膜炎等的发生[1]。目前，针对这类疾病临床最广泛的治疗方法是使用抗生素类药物，然而由于抗生素的广泛和不规范使用，导致了大量耐药菌和超级细菌的出现，严重威胁人类健康[2]，迫切需要研究者开发新型抗菌药物来抵御耐药菌和超级细菌。

抗菌肽是一种广泛存在于生物体内的抗菌药物，目前已知的可以从生物体内提取的抗菌肽超过2 817种[3-4]，然而天然抗菌肽存在结构复杂、提纯难度大等问题。随着科技的发展，人工合成技术已成为一种新型的开发和研制抗菌肽的方法[5-8]。人工合成抗菌肽通常以天然抗菌肽中活性多肽序列为基础。研究发现，抗菌肽通常富含疏水性氨基酸残基，包括亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸、色氨酸等；并含有大量的阳离子氨基酸，使抗菌肽具有2～9个正电荷。此外，这种两亲性结构对抗菌肽的抗菌性能至关重要[5]。

PAF26抗菌肽是由6个氨基酸组成的具有抗菌性能的两亲性多肽。据报道，PAF26多肽具有优异的抗菌性能，并且不会溶解和破坏人体细胞[9-10]。因此，作者以PAF26多肽为基础，在多肽序列中引入碱性氨基酸，同时引入相应数量的苯丙氨酸，设计了4个碱性氨基酸-PAF26衍生多肽,并研究其对真菌、革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌的抗菌性能。

1 实验

1.1 培养基和菌种

沙氏葡萄糖液体培养基、胰酪大豆胨液体培养基，广东环凯微生物科技有限公司。

白色念珠菌(ATCC10231)、金黄色葡萄球菌(ATCC6538)、大肠杆菌(ATCC25922)，上海鲁微科技有限公司。

1.2 碱性氨基酸-PAF26衍生多肽的设计

以PAF26多肽为基础，在多肽分子序列Ac-RKKWFW-NH2中引入2或4个碱性氨基酸：赖氨酸(K)或精氨酸(R)；为保持亲疏水氨基酸比例不变，引入相应数量的苯丙氨酸(F)。作者设计了赖氨酸-PAF26衍生多肽(K2-F2、K4-F4)和精氨酸-PAF26衍生多肽(R2-F2、R4-F4)，其分子序列和分子量见表1，委托吉尔生化(上海)有限公司合成。

表1 PAF26衍生多肽序列和分子量

1.3 碱性氨基酸-PAF26衍生多肽的抗菌性能测试

为研究碱性氨基酸-PAF26衍生多肽的抗菌性能，分别选择白色念珠菌(真菌)、金黄色葡萄球菌(革兰氏阳性菌)、大肠杆菌(革兰氏阴性菌)进行抗菌性能测试。

1.3.1 菌液的准备

白色念珠菌：取少量白色念珠菌第二代斜面菌株，接种至50 mL沙氏葡萄糖液体培养基中，26 ℃振荡培养。

金黄色葡萄球菌：取少量金黄色葡萄球菌第二代斜面菌株，接种至50 mL胰酪大豆胨液体培养基中，37 ℃振荡培养。

大肠杆菌：取少量大肠杆菌第二代斜面菌株，接种至50 mL胰酪大豆胨液体培养基中，37 ℃振荡培养。

将菌株培养过夜后，分别取0.2 mL菌液加入到25 mL新鲜培养基中进行再培养。用紫外可见分光光度计(UV1800PC，上海)测试600 nm处的吸光度值(OD)，待吸光度值达到0.1后，进行抗菌实验。

1.3.2 衍生多肽的抗菌性能测试

多肽溶液的配制：分别称取10 mg 衍生多肽，配制成浓度(mg·mL-1)为1.000、0.500、0.250、0.125、0.062、0.031、0.015的多肽溶液。

抗菌实验：将不同浓度多肽溶液分别加入到96孔板中，每孔100 μL；并选择超纯水作为阴性对照组，每个浓度设置6个平行样。紫外光照射1 h进行灭菌处理后，每孔分别加入100 μL吸光度值为0.1的白色念珠菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌的菌液；孵育10 min后，用酶标仪(DNM-9602，北京)测试初始吸光度值，记录为0 h吸光度值；将多肽溶液与菌液共培养24 h后，用酶标仪测试吸光度值，记录为24 h吸光度值。

2 结果与讨论

2.1 赖氨酸-PAF26衍生多肽的抗菌性能分析

2.1.1 白色念珠菌

K2-F2、K4-F4多肽与白色念珠菌共培养0 h和24 h的吸光度值见图1。

由图1可知，在沙氏葡萄糖液体培养基中，当K2-F2多肽浓度≥0.250 mg·mL-1、K4-F4多肽浓度≥0.500 mg·mL-1时，吸光度值显著增大，说明该浓度多肽溶解性较差。与白色念珠菌共培养24 h后，当K2-F2多肽浓度≥0.125 mg·mL-1、K4-F4多肽浓度≥0.250 mg·mL-1时，菌液的吸光度值相比0 h没有大幅增大，说明该浓度多肽有显著抑制白色念珠菌生长的效果，且K2-F2多肽的抗菌效果优于K4-F4多肽的。

2.1.2 金黄色葡萄球菌

K2-F2、K4-F4多肽与金黄色葡萄球菌共培养0 h和24 h的吸光度值见图2。

由图2可知，在胰酪大豆胨液体培养基中，当K2-F2、K4-F4多肽浓度≥0.500 mg·mL-1时，吸光度值显著增大，说明该浓度多肽溶解性较差。与金黄色葡萄球菌共培养24 h后，当K2-F2多肽浓度≥0.062 mg·mL-1、K4-F4多肽浓度≥0.125 mg·mL-1时，菌液的吸光度值相比0 h没有大幅增大，说明该浓度多肽有显著抑制金黄色葡萄球菌生长的效果，且K2-F2多肽的抗菌效果优于K4-F4多肽的。

a.K2-F2多肽 b.K4-F4多肽

a.K2-F2多肽 b.K4-F4多肽

2.1.3 大肠杆菌

K2-F2、K4-F4多肽与大肠杆菌共培养0 h和24 h的吸光度值见图3。

a.K2-F2多肽 b.K4-F4多肽

由图3可知，在胰酪大豆胨液体培养基中，当K2-F2、K4-F4多肽浓度≥0.500 mg·mL-1时，吸光度值显著增大，说明该浓度多肽的溶解性较差。与大肠杆菌共培养24 h 后，当K2-F2、K4-F4多肽浓度≥0.250 mg·mL-1时，菌液的吸光度值相比0 h没有大幅增大，说明该浓度多肽有显著抑制大肠杆菌生长的效果，且K2-F2的抗菌效果优于K4-F4多肽的。

2.2 精氨酸-PAF26衍生多肽的抗菌性能分析

2.2.1 白色念珠菌

R2-F2、R4-F4多肽与白色念珠菌共培养0 h和24 h的吸光度值见图4。

由图4可知，在沙氏葡萄糖液体培养基中，当R2-F2、R4-F4多肽浓度≥0.500 mg·mL-1时，吸光度值显著增大，说明该浓度多肽溶解性较差。与白色念珠菌共培养24 h后，当R2-F2多肽浓度≥0.125 mg·mL-1、R4-F4多肽浓度≥0.250 mg·mL-1时，菌液的吸光度值相比0 h没有大幅增大，说明该浓度多肽有显著抑制白色念珠菌生长的效果，且R2-F2多肽的抗菌效果优于R4-F4多肽的。和图1相比较，R2-F2、R4-F4多肽的抗菌效果优于K2-F2、K4-F4多肽的。

2.2.2 金黄色葡萄球菌

R2-F2、R4-F4多肽与金黄色葡萄球菌共培养0 h和24 h的吸光度值见图5。

a.R2-F2多肽 b.R4-F4多肽

由图5可知，在胰酪大豆胨液体培养基中，当R2-F2、R4-F4多肽浓度≥0.500 mg·mL-1时，吸光度值显著增大，说明该浓度多肽溶解性较差。与金黄色葡萄球菌共培养24 h后，当R2-F2多肽浓度≥0.031 mg·mL-1、R4-F4多肽浓度≥0.062 mg·mL-1时，菌液的吸光度值相比0 h没有大幅增大，说明该浓度多肽有显著抑制金黄色葡萄球菌生长的效果，且R2-F2多肽的抗菌效果优于R4-F4多肽的。和图2相比较，R2-F2、R4-F4多肽的抗菌效果优于K2-F2、K4-F4多肽的。

2.2.3 大肠杆菌

R2-F2、R4-F4多肽与大肠杆菌共培养0 h和24 h的吸光度值见图6。

由图6可知，在胰酪大豆胨液体培养基中，当R2-F2、R4-F4多肽浓度≥0.500 mg·mL-1时，吸光度值显著增大，说明该浓度多肽溶解性较差。与大肠杆菌共培养24 h后，当R2-F2多肽浓度≥0.125 mg·mL-1、R4-F4多肽浓度≥0.250 mg·mL-1时，菌液的吸光度值相比0 h没有大幅增大，说明该浓度多肽有显著抑制大肠杆菌生长的效果，且R2-F2多肽的抗菌效果优于R4-F4多肽的。和图3相比较，R2-F2、R4-F4多肽的抗菌效果优于K2-F2、K4-F4多肽的。

3 结论

设计了4种具有不同分子序列的碱性氨基酸-PAF26衍生多肽，并研究其对白色念珠菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌的抗菌性能。结果表明，相比于赖氨酸-PAF26衍生多肽，精氨酸-PAF26衍生多肽具有更加优异的抗菌效果；相比于引入4个碱性氨基酸，引入2个碱性氨基酸的PAF26衍生多肽具有更加优异的抗菌效果；相比于大肠杆菌，碱性氨基酸-PAF26衍生多肽对白色念珠菌、金黄色葡萄球菌具有更加优异的抗菌效果。为新型抗菌肽的设计和开发提供了参考。

a.R2-F2多肽 b.R4-F4多肽