云克对骨质疏松症患者成骨功能影响的研究

陈洁 周锡平 何成松 何跃

1.西南医科大学附属医院风湿免疫科，四川 泸州 646000 2.西南医科大学附属医院眼科，四川 泸州 646000

骨质疏松症(osteoporosis，OP)是一种以骨量减少和骨微结构破坏为特征，进而引发的骨密度下降、骨脆性增加和易于骨折的代谢性全身性骨病[1]，已成为我国中老年人群的重要健康问题[2]。成骨细胞引起的骨形成与破骨细胞引起的骨吸收间的平衡是维持骨结构完整性的关键环节[3]，成骨细胞自身特征变化导致骨重建失衡是骨质疏松症的根本原因之一[4]。我国自主研发的药物云克注射液其主要成分是锝[99Tc] (A剂)经氯化亚锡还原后与亚甲基二膦酸盐(methylenediphosphonate，MDP)(B剂)形成的螯合物，目前临床已应用于治疗骨质疏松症多年，发现云克可增加骨密度[5-6]，但目前尚无云克对骨质疏松症患者成骨细胞影响的研究。本研究将观察云克对体外培养的骨质疏松症患者成骨细胞增殖分化的影响，为临床应用云克治疗骨质疏松症提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1药品与试剂：Ⅰ型胶原酶(美国BD)；0.25% 胰蛋白酶(含EDTA)(美国 Hyclone)；胎牛血清(北京元亨金马生物技术开发有限公司)，DMEM培养基(高糖型)(美国 Hyclone)； Cell Counting Kit-8试剂盒(日本同仁)；碘化丙啶(美国 Sigma)；Protein Assay Kit(美国Bio-Rad)；碱性磷酸酶检测试剂盒(南京建成)；云克(成都云克药业有限责任公司)。

1.1.2仪器：SG403TX 生物安全柜(美国 BAKER)；Ckx41 Olympus荧光倒置显微镜(日本 Olympus)； Mco-18aic 二氧化碳培养箱(日本 SANYO)；Aria2 流式细胞仪(美国 BD)；Varioskan Flash 3001连续波长多功能酶标仪(美国 Thermo)。

1.2 方法

1.2.1成骨细胞的分离和培养：经医院伦理委员会批准，骨组织取材于接受髋关节置换的骨质疏松症患者，经知情同意后取材。充分剥离骨膜及软组织，无菌PBS液冲洗3次，置于盛有DMEM培养液小瓶中修整成1 mm×1 mm大小的碎块，再用PBS液多次冲洗，至骨片发白放入离心管内。用Ⅰ型胶原酶消化法获得成骨细胞，接种于无菌培养皿中，在5%CO2、95%湿度培养箱中37 ℃条件下培养。

1.2.2实验分组：药物干预组：云克。将A剂(每瓶5 mL，内含锝[99Tc](0.05μg)和B剂(MDP 5 mg、氯化亚锡0.5 mg)混合后充分振摇，经螯合反应后在常温下静置5 min，取上述溶液用完全培养液稀释为10-5、10-6、10-7、10-8、10-9mol/L(按MDP计)；阴性对照组：完全培养基。

1.2.3观察云克对成骨细胞增殖的影响：①CCK-8试剂盒检测细胞增殖。成骨细胞以2.5×103/孔接种于96孔板(每孔100 μL)，置于37 ℃，5% CO2的培养箱中培养。2 4 h后分别加入云克(浓度为10-5mol/L～10-9mol/L)和阴性对照，每组5个复孔。于干预后48 h测定。倒掉培养基，PBS洗2次，向每孔加入100 μL的新鲜DMEM培养基和10 μL的CCK-8溶液；空白孔加入100 μL的新鲜DMEM培养基和10 μL的CCK-8溶液作空白对照，将培养板置于37 ℃，5% CO2孵箱中孵育3 h。用酶标仪测定在450 nm处的吸光度(OD)，参比波长650 nm。记录结果。②流式细胞仪检测细胞周期。成骨细胞以4×105/皿接种于100 mm培养皿，置于37 ℃，5% CO2的培养箱中培养，24 h后加入云克(终浓度为10-8mol/L)和阴性对照，每组3个重复。于干预后48 h用胰酶消化收集细胞，PBS洗涤，1 000 r/min 5 min离心后弃上清，缓慢加入1 mL预冷70%的无水乙醇，轻柔混匀，制成细胞悬液，4 ℃固定过夜，1 000 r/min 5 min离心后弃上清，加入3 mL PBS重悬细胞5 min，400目筛网过滤1次，离心后弃上清，加入PI染液 1 mL，4 ℃、避光孵育30 min，流式细胞仪检测G0/G1、S、G2/M各期细胞数。激发光与接受光波长分别为488 nm，每个样本收集3×104个细胞。使用Modfit软件进行参数获取和结果分析，计算细胞周期分布。

1.2.4观察云克对成骨细胞分化功能的影响：①碱性磷酸酶(ALP)活性测定。成骨细胞以5×104/孔接种于12孔培养板，置于37 ℃，5% CO2的培养箱中培养。24 h后加入云克(终浓度为10-5mol/L～10-9mol/L)和阴性对照，每组3个重复。于加药后3 d收集细胞，加入细胞裂解液80μL4℃震荡裂解半小时，离心收集上清。于96孔板中依次加入上述溶液，每孔各30 μL，用ALP试剂盒(对硝基苯磷酸盐法，PNPP)按说明进行检测，酶标仪测定反应后溶液的吸光度(波长为520 nm)，再用考马斯亮蓝法测定样本中蛋白质含量，以U/mg蛋白质表示ALP活性，结果与对照组比较。②矿化结节计数。成骨细胞以1×104/孔接种于24孔培养板，置于37 ℃，5% CO2的培养箱中培养。24 h后加入云克(终浓度为10-8mol/L)和阴性对照，每组3个重复。每48 h更换培养液1次。14 d加入含10 mmol/L β-甘油磷酸钠，50 mg/L 抗坏血酸的完全培养基。培养板用PBS冲洗，2.5%戊二醛室温固定15 min，PBS(pH 4.2)冲洗，2%茜素红37 ℃孵育10 min，PBS(pH 4.2)冲洗，显微镜下观察。用有格(0.2 mm×0.2 mm)涤纶薄膜贴附于培养板底部，以橘红色结节、边界清晰、>200 μm为标准，在40倍光镜下作结节计数。

1.2.5Real-time RT-PCR检测骨钙素(OC) mRNA和骨形成蛋白(BMP)-2 mRNA的表达：成骨细胞以1×105/孔接种于6孔培养板，置于37 ℃，5% CO2的培养箱中培养。24 h后加入云克(终浓度为10-8mol/L)和阴性对照，每组3个重复，于干预后72 h收集细胞进行检测。RNA 提取采用TRIzol试剂盒提取 RNA。采用反转录酶试剂盒反转录合成cDNA。采用以下两步法PCR反应程序进行Real Time PCR：预变性：94℃×120 s，循环数为1；PCR反应：94℃×20 s，58℃(OC)/54℃(BMP-2)/50℃(GAPDH)×20 s，72℃×40 s循环数为45。采用2-△△CT相对定量法进行统计学分析。GAPDH作为内参。引物序列见表1。

表1 引物序列Table 1 Primer sequences

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 云克对成骨细胞增殖的影响

2.1.1CCK-8法检测细胞增殖：10-5mol/L～10-9mol/L云克组对成骨细胞均有促进增殖的作用，以10-8mol/L组达高峰，各组与阴性对照组相比差异有统计学意义(P<0.05)。说明云克在此浓度范围下有促进成骨细胞增殖的作用(图1)。

图1 云克对成骨细胞增殖的影响(各组与阴性对照比较，*P<0.05)Fig.1 Effect of Yunke on the proliferation of OB (*P<0.05 over control)

2.1.2云克对成骨细胞周期的影响：10-8mol/L浓度的云克作用下，成骨细胞S期细胞(S-phase fraction，SPF)明显增多，与阴性对照相比差异有统计学意义(P<0.05)；G2/M期细胞略有增多，但与阴性对照相比差异无统计学意义(P>0.05)；G0/G1期细胞明显减少，与阴性对照相比差异有统计学意义(P<0.05)；细胞增殖指数(PI)明显增高(P<0.05)(图2)。

2.2 云克对成骨细胞分化功能的影响

2.2.1ALP活性测定：结果显示，10-5mol/L～10-9mol/L云克组对成骨细胞ALP活性均有促进作用，以10-8mol/L组最明显，各组与阴性对照组相比差异有统计学意义(P<0.05)。表明云克在此浓度下对成骨细胞ALP活性有促进作用(图3)。

2.2.2矿化结节计数：10-8mol/L浓度的云克作用下，成骨细胞形成矿化结节数量增多，与阴性对照相比差异有统计学意义(P<0.05)(图4)。

2.3 骨钙素mRNA和BMP-2 mRNA的表达情况

经Real-time PCR检测，10-8mol/L浓度的云克作用下，成骨细胞骨钙素mRNA表达较阴性对照稍有增高，但差异无统计学意义(P>0.05)(图5A)；BMP-2 mRNA表达较阴性对照明显增高，差异有统计学意义(P<0.05)(图5B)。

3 讨论

云克注射液是中国核动力研究设计院成都同位素应用研究所自主研发的世界首创的治疗类风湿关节炎、骨质疏松症等多种骨破坏性疾病的核素药物，其主要成分是锝[99Tc] (A剂)经氯化亚锡还原后与亚甲基二膦酸盐(B剂)形成的螯合物[7]。为防止分解，制成A剂人工微量元素溶液，B剂为注射用亚锡亚甲基二膦酸盐冻干粉，混合后充分振摇，经螯合反应后在常温下静置5 min作静脉注射。研究发现云克有多种药理作用，包括抑制炎症反应、调节免疫及对骨代谢的调节作用等，当云克进入关节腔到达滑膜炎症部位或异常的骨骼区域时，即与该处未成熟的胶原结合或被羟基磷灰石结晶吸附，这样能较长时间发挥药物的物理和化学效应，起到治疗作用[7]。动物实验发现云克注射液对糖皮质激素性骨质疏松大鼠有治疗作用[8]。临床运用发现云克注射液可提高骨质疏松症患者骨密度，并有良好的安全性[6]。

图2 流式细胞仪检测云克对成骨细胞细胞周期的影响(各组与阴性对照比较，*P<0.05)Fig.2 Effect of Yunke on cell cycle of OB detected with flow cytometry(*P<0.05 over control)

图3 PNPP法检测云克对成骨细胞ALP活性的影响(各组与阴性对照比较，*P<0.05)Fig.3 Effect of Yunke on ALP activity of osteoblast detected with PNPP assay(*P<0.05 over control)

成骨细胞的主要作用是形成骨基质和调节破骨细胞的骨吸收，在骨形成、骨构塑(bone modeling)与骨重建(bone remodeling)中起重要作用。成骨细胞的分化过程由细胞增殖、细胞外基质形成及成熟、骨基质矿化3个阶段组成。在细胞增殖阶段，I型胶原达最高峰，产生大量骨基质，为骨基质成熟和矿化提供基质网架；在骨基质成熟期，细胞增殖减弱，ALP活性增高达最高，表明骨基质成熟；骨基质矿化阶段，ALP活性逐渐下降，骨钙素基因的表达明显增加，细胞有多个骨结节形成，进入骨基质矿化阶段[9]。因此，对骨形成促进药物的体外细胞药效可从OB的增殖功能和分化功能来评价。

本实验首先检测细胞的增殖功能，结果显示云克在10-5mol/L～10-9mol/L浓度下有促进成骨细胞增殖的作用。然后通过流式细胞仪对细胞周期进行检测，实验结果显示在10-8mol/L浓度下，云克可使成骨细胞S期细胞明显增多(P<0.05)，细胞增殖指数(PI)明显增高(P<0.05)，进一步说明了云克有促进成骨细胞增殖的作用。

图4 茜素红染色检测云克对成骨细胞矿化结节的影响(各组与阴性对照比较，*P<0.05)Fig.4 Effect of Yunke on mineralized nodules in OB detected with Alizarin red staining(*P<0.05 over control)

图5 云克对成骨细胞骨钙素和BMP-2 mRNA表达的影响(各组与阴性对照比较，*P<0.05)Fig.5 Effect of Yunke on mRNA expression of OC and BMP-2 in OB(*P<0.05 over control)

ALP为成骨细胞分化的早期标志，其活性越高说明前成骨细胞向成熟成骨细胞分化越明显[10]。实验结果显示云克在10-5mol/L～10-9mol/L浓度下对成骨细胞ALP活性有明显促进作用，说明云克有促进成骨细胞向成熟成骨细胞分化的作用。矿化结节形成代表了成骨细胞分化成熟，是成骨功能的形态表现，实验结果显示10-8mol/L浓度的云克有促进成骨细胞形成矿化结节的作用。

骨形成蛋白2(bone morphogenetic proteins，BMP-2)属于转化生长因子β(transforming growth factor-β，TGF-β)超家族成员，具有良好的异位诱导成骨作用，是BMP家族中诱骨活性最强的一种，也是唯一能单独诱导成骨的细胞因子[11]。研究发现，BMP-2转染的骨髓基质细胞比原代骨髓基质细胞具有更好的成骨分化能力[12]。本实验结果显示，10-8mol/L浓度的云克可明显促进BMP-2 mRNA表达(P<0.05)。

骨钙素是成骨细胞分化成熟的标志，反映成骨细胞的成骨功能[13]。由于细胞培养液中含骨钙素太少，所以对骨钙素mRNA表达水平进行了检测，以反映骨钙素表达情况。实验结果显示，云克组骨钙素mRNA表达较阴性对照有增高趋势，但差异无统计学意义(P>0.05)，这可能是由于骨钙素表达高峰是在骨形成的晚期骨基质矿化阶段，而本研究对细胞进行检测的的时间尚处于骨形成的早期，所以推测这可能是骨钙素mRNA表达水平没有明显增高的原因，在以后的实验中将就此问题进行进一步的探讨。

综上所述，云克能促进骨质疏松症患者成骨细胞增殖和分化，促进成熟的成骨细胞特异性分泌骨形成所需的ALP和BMP-2，提高骨质疏松症患者成骨细胞骨形成的功能，这可能是云克治疗骨质疏松症的机制之一。