补肾健骨中药复方对去卵巢骨质疏松症大鼠骨组织Leptin启动子甲基化的影响

王剑 丰雪妮 刘剑辉 谢剑 刘文艳 张景云 宋光熠 郑洪新

1.辽宁省基础医学研究所，辽宁 沈阳 110101 2.辽宁中医药大学，辽宁 沈阳 110847

绝经后骨质疏松症(postmenopausal osteoporosis，PMOP)是女性绝经后雌激素水平下降导致的高转换型骨质疏松，严重影响绝经后女性的生活质量。近年研究显示，主要由脂肪细胞合成、分泌，参与调节糖、脂及能量代谢的肽类激素——瘦素(Leptin，LP)亦表达于骨组织，与骨代谢密切相关[1]，DNA甲基化可调控骨代谢相关基因的表达，影响骨质疏松的发生、发展[2-3]。本研究基于骨组织Leptin启动子甲基化水平，探索PMOP发病以及“肾主骨”理论指导之补肾健骨中药复方疗效的分子机制，为中医药防治PMOP提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 动物

SPF级Wistar大鼠(许可证号：SCXK[辽]2015-0001，辽宁长生生物技术股份有限公司)61只，3月龄，雌性未交配，体重(240±20) g。大鼠饲养于室温20 ℃～25 ℃、湿度35%～65%的基础所药理动物室，以辽宁长生生物技术股份有限公司提供的大小鼠维持饲料饲喂。

1.2 分组与造模

随机分出12只大鼠为正常组，余者腹腔注射3%戊巴比妥钠麻醉(35 mg/kg)后，经腹部切口完整切除双侧卵巢。随机将术者分为模型组、补肾健骨中药复方组和仙灵骨葆阳性对照组，分别为12只、18只、19只。仙灵骨葆阳性对照组灌胃期间死亡1只。

1.3 药物

补肾健骨中药复方(由辽宁宏宇生物科技有限公司提供的鹿茸冻干粉、四川新绿色药业科技发展有限公司提供的淫羊藿颗粒和产于长山岛大连湾、制成平均粒径780 nm的牡蛎壳微粉组成)；仙灵骨葆胶囊(由国药集团同济堂[贵州]制药有限公司生产，批号180417，国药准字Z20025337，成分：淫羊藿、续断、丹参、知母、补骨脂、地黄)。

1.4 剂量与给药方法

补肾健骨中药复方组和仙灵骨葆阳性对照组给药剂量按成人6.3倍计算，分别给补肾健骨中药复方[鹿茸0.315 g/(kg·d)、淫羊藿0.15 g/(kg·d)、牡蛎1.05 g/(kg·d)]和仙灵骨葆胶囊粉0.315 g/(kg·d)，给药体积：1 mL/100 g。正常组和模型组给等体积生理盐水。术后6 d开始灌胃，1次/d(灌胃6 d，停灌1 d)，给药14周。

1.5 取材

末次灌胃给药后，禁食24 h，取第1～6腰椎，生理盐水冲洗，医用纱布包好，再以锡纸包于其外，保存在-80 ℃冰箱内，待检测骨密度；取股骨头，10%福尔马林溶液固定，待做石蜡切片HE染色；取股骨头，装入液氮冻存管，先以液氮速冻，再保存在-80 ℃冰箱内，待检测甲基化。

1.6 指标检测

1.6.1骨密度(bone mineral density，BMD)：用X射线骨密度测定仪(STRATOS DR，Diagnostic Medical System SA，法国)检测第1～6腰椎骨密度。

1.6.2骨组织显微形态结构：10%硝酸脱钙制作股骨头脱钙石蜡切片，HE染色，OLYMPUS BX51显微镜(日本)观察骨组织形态结构并拍照(400倍)。

1.6.3Leptin启动子甲基化：质谱法检测：由北京博奥晶典生物技术有限公司完成。检测片段：Leptin基因启动子-493 bp～-19 bp，长度475 bp，CpG位点总数27个，能检测到26个CpG位点。①引物设计： Leptin修饰后的上游引物：aggaagagagGGGTATTAAAGGATAGTTTTTGTTTTG，修饰后的下游引物：cagtaatacgactcactatagggagaa ggctACTCCATACCTACCTACCCCTCTTA。②使用QIAamp DNA Mini Kit(QIAGEN，51304)提取骨组织DNA。③使用EZ DNA Methylation-Gold Kit(ZYMO，D5005)、PCR仪(96孔，BIORAD)对DNA样品进行重亚硫酸盐处理。④使用PCR Accessory Set(SEQUENOM，11327)和步骤①设计、合成的引物、S1000TM Thermal Cycler(384孔，BIORAD)扩增重亚硫酸盐处理后的样品。⑤使用MassCLEAVE Kit(SEQUENOM，10129.1)、S1000TM Thermal Cycler(384孔，BIORAD)对步骤④的PCR产物进行碱性磷酸酶处理(SAP)。⑥使用MassCLEAVE Kit(SEQUENOM，10129.1)、S1000TM Thermal Cycler(384孔，BIORAD)将SAP处理后的PCR产物进行体外转录和RNase酶切。⑦使用Spectro CHIP©Arrays and Clean Resin Kit(SEQUENOM，10117)、MassARRAY Nanodispenser(RS1000，SEQUENOM)将酶切产物纯化、点样、质谱分析。

1.7 统计学分析

2 结果

2.1 各组大鼠离体第1～6腰椎骨密度

模型组与正常组相比，骨密度显著降低(P<0.01)；补肾健骨中药复方组、仙灵骨葆阳性对照组与模型组相比，骨密度显著升高(P<0.05)。见表1。

表1 各组大鼠离体第1～6腰椎骨密度

2.2 各组大鼠股骨头显微形态结构

与正常组比较，模型组骨皮质骨板变薄，骨松质骨小梁明显变细，有些部位破坏、断裂，骨髓腔明显扩大；与模型组比较，补肾健骨中药复方组、仙灵骨葆阳性对照组上述病理改变均明显改善。见图1。

图1 各组大鼠股骨头石蜡切片HE染色显微形态结构(400倍)Fig.1 Micro-morphology structure of HE stained paraffin section of the femoral head of rats in each group (400 times)

2.3 各组大鼠骨组织Leptin启动子-493 bp～-19 bp甲基化

Leptin基因启动子-493 bp～-19 bp检测片段含有27个CpG位点，位点6未检测到。图2、表2显示：与正常组比较，模型组CpG19、CpG22.23甲基化水平显著升高(P<0.05)，其余位点甲基化差异不显著。与模型组比较，补肾健骨中药复方组(P<0.01)、仙灵骨葆阳性对照组(P<0.05)CpG19甲基化水平显著降低，其余位点甲基化差异均不显著。

3 讨论

中医理论认为肾为先天之本，藏精生髓主骨。肾精充盛、生髓有源、骨得濡养而强劲有力；肾虚精亏、生髓乏源、骨失濡养而痿弱无力，发为骨质疏松。女子七七天癸竭，肾虚精亏，髓减骨枯，而引发绝经后骨质疏松症。故PMOP的根本病机是肾虚，临床防治该病应补肾以健骨。

近年对骨质疏松的研究偏重表观遗传，包括DNA甲基化、组蛋白修饰、非编码RNA、染色质重塑等[4-5]，其中DNA甲基化的研究颇受青睐。DNA甲基化是DNA甲基转移酶催化甲基转移至DNA分子CpG的胞嘧啶上，甲基化基团阻止转录因子结合调控序列，抑制基因转录，调控骨代谢相关基因的表达，影响骨质疏松的发生、发展[2-3]。骨形态发生蛋白(bone morphogenetic proteins，BMPs)家族中诱导成骨分化效应最强的BMP9启动子甲基化下调其表达[6]。成骨重要基因Runx2、骨钙素表达升高与相应启动子甲基化降低密切相关[7]。抑制DNA甲基化会使成骨特异基因Osterix表达[8]。激活后可促进成骨细胞分化、增殖的PI3K/AKT信号通路的PIK3AP1启动子高甲基化下调其表达[9]。左归丸含药血清下调Runx2、Osterix甲基化，促进骨髓间充质干细胞(bone mesenchymal stem cells，BMSCs)成骨分化[10]。课题组同期研究表明，去卵巢骨质疏松症大鼠骨组织Dlx5、Runx2、Osterix启动子甲基化水平明显升高，补肾中药复方(鹿茸、淫羊藿、牡蛎，功效为补肾填精、益髓壮骨)通过降低骨组织Dlx5、Runx2、Osterix启动子甲基化，有效防治PMOP[11-12]。

瘦素由肥胖基因编码、主要由脂肪细胞合成，是蛋白质类激素，分泌入血运送至靶器官，通过结合瘦素受体发挥生物学效应，参与调节糖、脂及能量代谢[13]。近年研究显示，瘦素亦表达于骨组织，与骨代谢密切相关[1]，可能为骨质疏松的防治提供新的靶点。研究显示，瘦素可增加BMSCs表达碱性磷酸酶、骨钙素、骨桥蛋白、核心结合因子α1，促进其成骨分化[14-16]。瘦素可上调Ⅰ型胶原蛋白表达，促进骨形成[17]。雌性瘦素基因缺乏鼠，皮下注射瘦素可显著促进其腰椎及股骨干骺端骨形成[18]。温阳通络方可明显升高去卵巢联合氢化可的松造模的肾阳虚证大鼠血清瘦素水平而有效增加其骨密度[19]。补肾健脾方可上调大鼠血清和骨组织中瘦素、瘦素受体的表达，改善骨代谢，防治原发性骨质疏松症[20]。课题组前期研究表明[21-22]，去卵巢骨质疏松症大鼠下丘脑Leptin蛋白水平显著升高、骨组织Leptin蛋白表达显著降低；补肾中药复方(鹿茸、淫羊藿、牡蛎，功效为补肾填精、益髓壮骨)可降低下丘脑Leptin蛋白水平、上调骨组织Leptin蛋白表达，有效防治PMOP。

图2 骨组织Leptin基因启动子-493 bp～-19 bp各CpG位点甲基化程度图谱Fig.2 Methylation degree map of leptin gene promoter -493 bp - -19 bp CpG sites in bone

研究显示，甲基化负调控瘦素基因表达[23]。那么，骨质疏松症的发病以及药物的作用靶点是否与瘦素基因甲基化调控机制有关呢？本实验摘除雌性大鼠双侧卵巢建立经典的PMOP模型[24]，以骨组织Leptin基因启动子-493 bp～-19 bp甲基化水平为效应指标，探究PMOP发病和中医“肾主骨”理论指导下的补肾健骨中药复方(以补肾生精、强筋健骨之鹿茸为君药；以温补肾阳、强筋健骨之淫羊藿为臣药；佐以补肾壮骨、滋阴潜阳之牡蛎，全方共奏补肾填精、生髓健骨之功)防治PMOP的分子机制，以仙灵骨葆胶囊为阳性对照药(功效为滋补肝肾、接骨续筋、强身健骨)。结果表明，模型组与正常组相比，第1～6腰椎骨密度显著降低；股骨头骨皮质骨板变薄，骨松质骨小梁明显变细，有些部位破坏、断裂，骨髓腔明显扩大，说明PMOP模型复制成功。补肾健骨中药复方组、仙灵骨葆阳性对照组与模型组相比，第1～6腰椎骨密度均显著升高；股骨头显微形态结构病理改变均明显改善，说明本研究补肾健骨中药复方可有效防治PMOP。模型组与正常组相比，骨组织Leptin启动子-493 bp～-19 bp CpG19、CpG22.23甲基化水平显著升高，说明去卵巢造成骨组织Leptin启动子高甲基化，从而抑制其转录，下调其表达，进而下调核心结合因子α1、碱性磷酸酶、骨钙素、骨桥蛋白、Ⅰ型胶原表达，抑制成骨细胞分化和骨形成，导致骨质疏松。补肾健骨中药复方组、仙灵骨葆阳性对照组与模型组相比，骨组织Leptin启动子-493 bp～-19 bp CpG19甲基化水平显著降低，说明补肾健骨中药复方和仙灵骨葆均可降低去卵巢骨质疏松症大鼠骨组织Leptin启动子甲基化，从而促进其转录，上调其表达，进而上调核心结合因子α1、碱性磷酸酶、骨钙素、骨桥蛋白、Ⅰ型胶原表达，促进成骨细胞分化和骨形成，有效防治PMOP。

表2 各组大鼠骨组织Leptin基因启动子-493 bp～-19 bp甲基化水平Table 2 Methylation level of leptin gene promoter -493 bp - -19 bp in bone of rats in each group

本研究表明，骨组织Leptin启动子甲基化水平升高是PMOP发病的分子机制之一；补肾健骨中药复方功能补肾填精、生髓健骨，通过降低骨组织Leptin启动子甲基化水平的分子机制，有效防治PMOP。本研究为中医“肾主骨”理论提供了科学的实验依据，并为PMOP的防治提供了新的有效靶点。