基于网络药理学及生物信息学研究骨碎补-淫羊藿治疗骨质疏松的作用机制

陈锋 章晓云,* 陈跃平 李华南 甘斌 陈丁鹏 宋世雷 廖建钊

1.广西中医药大学附属瑞康医院，广西 南宁 530011 2.江西中医药大学，江西 南昌 330004

骨质疏松(osteoporosis，OP)是一种全身性、代谢性骨骼疾病，以骨量减少、骨脆性增加、骨强度降低及骨组织微观结构破坏为主要特征[1]。临床以抑制破骨、促进成骨和钙化等为主要原则，然而单纯采用现代医学治疗OP存在毒副作用多、难以有效调控骨代谢动态平衡等问题，其治疗效果并不理想[2]。随着中医药的不断发展，其在OP的预防和治疗等方面取得良好效果，中药抗骨质疏松的作用机制逐步进入研究者的视野[3]。

骨碎补和淫羊藿是中医治疗骨伤科疾病的传统药对，已广泛应用于骨质疏松的治疗过程中，现代研究表明二者的提取物具有增加骨密度，促进成骨分化、抑制破骨活动和改善骨组织微观结构的作用[4-5]。但骨碎补和淫羊藿的活性成分众多，作用靶点丰富，分子机制尚不明确。基于此，本研究利用网络药理学和生物信息学从分子水平探讨“骨碎补-淫羊藿”治疗OP的具体作用机制，以期为下一步深入研究提供方向和参考。

1 材料与方法

1.1 活性成分筛选

利用中药系统药理学分析平台(TCMSP)，以“骨碎补”“淫羊藿”为关键词检索化学成分。以口服生物利用度(oral bioavailability，OB)≥30%、类药性(drug-likeness，DL)≥0.18为筛选条件在TCMSP数据库中筛选出2味中药的活性成分，最终确定活性成分集合。

1.2 靶标蛋白筛选

基于TCMSP数据库对筛选出的活性成分进行检索，查找与之对应的靶标蛋白，并运用Uniprot数据库查询靶标蛋白对应的基因名，将得到的靶基因名进行合并及删除重复项，最终所得结果即为“骨碎补-淫羊藿”活性成分的靶点。

1.3 筛选OP作用靶点

在GEO数据库中检索与OP相关的芯片，获得编号为GSE56116的矩阵文件和GPL4133基因注释文件，该芯片中包含13个血液样本，其中OP患者10例，健康对照3例。利用R语言对其进行基因重注释、分类和校正，limma包分析差异基因，并设置差异倍数(fold change，FC)>0.5，P<0.05；最后运用pheatmap包对差异基因绘制热图。

1.4 “单味药-活性成分-作用靶点”网络构建

在药物作用的靶点和疾病的差异基因之间取交集，以交集基因为桥梁，整合交集基因所对应的药物活性成分，获取“骨碎补-淫羊藿”治疗OP的关系网络，并导入到 Cytoscape3.7.2软件中，构建“单味药-活性成分-作用靶点”网络图。

1.5 PPI网络构建

将交集基因导入Cytoscape软件中的Bisogenet插件，限定研究物种为“Homo Sapiens”获得蛋白互作关系，并运用CytoNCA插件设置DC>61和BC>58，筛选富集程度高的蛋白互作关系，构建PPI核心网络图。

1.6 分子对接

利用Chem Office软件制作关键化合物的3D结构，再从PDB数据库下载核心蛋白基因的3D结构，利用PyMOL软件对蛋白质进行去水、去磷酸根等操作，利用Auto Dock1.5.6软件将化合物及核心蛋白基因pdb格式转为pdbqt格式并寻找活性口袋，最后运行Vina进行对接。根据结合能大小来评估二者的结合活性，选取结合能≤-5.0 kJ/mol作为筛选依据，以评价网络分析预测的可靠性。

1.7 GO与KEGG分析

利用DAVID数据库对关键基因进行GO功能富集分析，研究“骨碎补-淫羊藿”治疗OP的主要生物功能；对关键基因进行KEGG通路富集分析，研究“骨碎补-淫羊藿”治疗OP的主要信号通路，P<0.05代表富集结果显著。最后利用R语言绘制GO和KEGG富集分析气泡图。

1.8 KEGG关系网络构建

根据步骤1.7所得的信号通路，分析每条信号通路所调控的差异基因，获得通路与基因的关系网络。将该网络导入Cytoscape中，选取前15条通路绘制“KEGG信号通路-差异基因”关系网络图。

2 结果

2.1 活性成分筛选

通过TCMSP数据库共获得化学成分261个，再以OB≥30%和DL≥0.18为过滤条件对其进行筛选，共得到41个活性成分(骨碎补18个、淫羊藿23个)。其中有2个交集化合物，删除重复项后剩余39个活性成分，基本信息见表1。

表1 “骨碎补-淫羊藿”活性成分基本信息Table 1 Basic information of active components in drynariae rhizoma-epimedii folium

2.2 OP作用靶点的筛选

利用R语言对芯片进行分析，共得到971个明显改变的基因，其中上调基因541个，下调基因430个。在上调和下调的基因中分别选取前20个绘制差异基因热图，见图1。图中前3列为健康对照组的基因，后10列为OP患者的基因，颜色则代表该基因在不同样品中表达的程度，绿色代表低表达，黑色代表中表达，红色代表高表达。而在整组差异基因中，变异程度越高，对OP发生发展造成影响的可能性越大。变异程度最高的蛋白基因为CYP1B1、UBR7、SERPINA6、ANPEP、TMEM51。

2.3 “单味药-活性成分-作用靶点”网络

药物作用的靶点基因和疾病的差异基因之间共存在17个交集基因，整合交集基因所对应的活性成分，构建“骨碎补-淫羊藿”治疗OP的“单味药-活性成分-作用靶点”网络，见图2。该网络中度值排名前5位的化合物分别是槲皮黄素、山柰酚、木犀草素、淫羊藿苷元、豆甾醇，其基本信息见表2。

图2 单味药-活性成分-作用靶点网络Fig.2 Single drug-active component-target network

2.4 PPI网络及拓扑分析

利用Cytoscape软件的Bisogenet和CytoNCA插件构建PPI核心网络，其过程见图3。结果显示度值排名前5的蛋白基因为ESR1、PRKDC、HSPA8、EP300和HSP90AA1，这些度值较大的蛋白基因在整个网络中起着关键作用，可能是治疗OP的关键靶点，其基本信息见表3。

2.5 分子对接

以结合能≤-5.0 kJ/mol为标准，对关键活性成分和关键靶点进行分子对接验证(PRKDC由于缺少相应的配体结构未能与关键活性成分进行对接)。结果显示二者对接的亲和力远小于-5.0 kJ/mol，由此表明关键活性成分与关键靶点间具有较好的结合活性，证明该研究的预测较为可靠，结果见表4。选取亲和力最低的木犀草素和ESR1进行分子对接展示，见图4。

图3 PPI网络拓扑分析Fig.3 Network topology analysis of PPI

表2 关键化合物的基本信息Table 2 The basic information on the key compounds

2.6 GO和KEGG分析

GO富集分析共得到68个条目，其中生物过程59个、细胞成分5个、分子功能4个；KEGG富集分析共得到15条通路，根据P排序，选取富集最显著析结果显示，“骨碎补-淫羊藿”治疗OP主要包括异源代谢、固醇代谢、破骨细胞分化的调控等生物学过程，涉及MAPK、NF-κB、PI3K-AKT及HIF-1等信号通路。

表3 关键靶点的基本信息Table 3 The basic information of the key targets

表4 关键活性成分与关键靶点对接的结合能

图4 木犀草素和ESR1的分子对接图Fig.4 Molecular docking diagram of luteolin and ESR1

图5 GO和KEGG信号通路可视化结果Fig.5 Visualization results of GO and KEGG signaling pathways

的10个条目以气泡图形式展现(不足则选取全部)，见图5。图中横坐标为该通路富集的基因占人体总基因的比例，气泡越大代表该通路富集的基因数越多，颜色越红则代表富集程度越显著。分

2.7 KEGG关系网络构建

通过Cytoscape软件对靶点-信号通路关系网络进行可视化处理，构建“KEGG关系网络图”，见图6。内圈长方形代表基因，外圈三角形代表KEGG信号通路，如果KEGG信号通路和基因之间有连线则说明该基因属于这条通路，图形越大则代表连接节点越多。结果显示“骨碎补-淫羊藿”的各有效成分是通过多靶点、多信号通路共同起到治疗OP的作用。

图6 KEGG关系网络图Fig.6 Diagram of KEGG network

3 讨论

中医学将OP归为“骨痿”“骨枯”等范畴，认为OP的发病以肾虚为本，临床治疗上以补肾壮骨、益精填髓为主[6]。骨碎补和淫羊藿是骨伤科常用药物，具有补肝肾，强筋骨等功效[7]，两者经常组成药对出现在治疗OP的药方中，但其药理机制尚未清楚。因此运用网络药理学和生物信息学探讨二者联用下的药理机制。

单味药-活性成分-作用靶点网络显示“骨碎补-淫羊藿”治疗OP具有多成分、多靶点的特点，结果显示槲皮黄素、山柰酚、木犀草素、淫羊藿苷元、豆甾醇等是其关键有效成分。研究证实槲皮黄素可通过作用于ERK通路抑制脂肪干细胞增殖并促进其成骨分化[8]，而山奈酚可增加骨密度、改善骨微结构，能有效治疗OP[9]。另有研究显示木犀草素不仅能减少破骨细胞形成，还可降低其骨吸收能力[10]。淫羊藿苷元具有促骨髓间质干细胞成骨分化的作用[11]。豆甾醇具有抗氧化作用，能抑制软骨降解，具有治疗OP的潜力[12]。除豆甾醇之外，其他4种活性成分均属黄酮类药物，该类药物与雌激素在体内的功效高度相似，具有促进成骨、抑制破骨等作用，且毒副作用小，可开发为有效防治OP的药物[13]。且从图2可以看出，豆甾醇可单独作用于靶点ADRA1B，槲皮黄素可单独作用于靶点FOS，而二者又可共同作用于靶点RXRA。故笔者认为“骨碎补-淫羊藿”各有效成分之间存在紧密的协同作用，是治疗OP的关键有效成分。

蛋白互作网络表明ESR1、PRKDC、HSPA8、EP300和HSP90AA1可能是“骨碎补-淫羊藿”治疗OP的关键靶点。ESR1编码雌激素受体，可与ESR2形成二聚体从而表现出雌激素样作用[14]。而雌激素的减少不仅会使成骨细胞数目减少，活性降低，更会让破骨细胞凋亡受抑制，从而诱发OP[15]。PRKDC参与多种细胞途径，其表达的抑制会导致体内DNA-DSBs水平增加从而诱导细胞凋亡，然而其在上述细胞途径中的潜在作用仍不清楚[16]，这就为以后通过作用PRKDC来治疗OP的研究提供新的方向和线索。EP300蛋白在细胞增殖和分化过程中发挥重要的调节作用，具有治疗OP的潜力[17]。HSPA8与HSP90AA1二者均属于热休克蛋白，维持着细胞蛋白的稳态和正常功能。研究表明通过下调HSPA8和HSP90AA1能够调控MAPK通路中与成骨相关的转录因子，促进间充质干细胞向成骨方向分化[18-19]。对上述靶点分析表明，通过作用这些靶点有望达到治疗OP的目的。

GO富集分析显示“骨碎补-淫羊藿”治疗OP的基因功能主要体现在异源代谢、固醇代谢、破骨细胞分化的调控等过程，与文献报道相符[20]。KEGG信号通路主要富集在MAPK、NF-κB、PI3K-AKT及HIF-1信号通路。①MAPK信号通路：MAPK是细胞内的一类丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，调控成骨细胞生长和分化，在抑制骨吸收、促进成骨分化等方面发挥重要作用，对治疗OP意义重大[21]。②NF-κB信号通路：NF-κB是一种蛋白质复合物，能够调控多种炎症因子的表达和细胞凋亡，在骨形成和骨吸收中起到重要作用。研究证明破骨细胞在吸收骨组织时候会释放炎症因子，而通过作用NF-κB信号通路可明显抑制破骨细胞的活动、消除机体的炎症反应[22]。③PI3K-AKT信号通路：PI3K信号通路主要调控体内细胞的增殖、分化和凋亡，PI3K被激活后会募集下游信号分子AKT，同时促进mTOR的活化来影响成骨细胞分化，并抑制其凋亡，对治疗OP有重要指导意义[23]。④HIF-1信号通路：HIF-1信号通路是一种典型的低氧反应通路，研究表明在骨的生成过程中HIF-1可以调控成骨细胞的增殖和迁移，并对骨存在保护效应[24]。对上述通路的分析表明“骨碎补-淫羊藿”主要在成骨、破骨和炎症等方面发挥作用，通过作用于此类靶点来调控骨代谢达到动态平衡从而达到治疗OP效果。同时通过图6可知，槲皮黄素可通过作用GSTM1、GSTM2等靶点来调控PI3K-AKT信号通路；而山柰酚同样可通过作用GSTM1来调控PI3K-AKT信号通路。各有效成分通过多靶点、多信号通路共同起到治疗OP的作用。

综上所述，本研究利用网络药理学和生物信息学对“骨碎补-淫羊藿”治疗OP的潜在作用机制进行了分析，结果表明各有效成分与作用靶点之间不仅存在密切的协同关系、良好的结合活性，而且从侧面反映出中医药治疗疾病具有多成分、多靶点、多信号通路的特色，与中医整体观念思想不谋而合。这为后续使用“骨碎补-淫羊藿”进行OP的临床治疗提供了重要的理论基础，但仍需结合体内外实验进一步验证，以期阐明其分子作用机制，促进中药现代化发展。