基于系统药理学和分子对接探讨青娥丸治疗绝经后骨质疏松症的作用机制

范晓茜 陈锋 杨文娜

1.广西中医药大学，广西 南宁 530200 2.广西中医药大学附属瑞康医院，广西 南宁 530011

骨质疏松(osteoporosis，OP)是一种代谢性骨病，主要是由于骨量丢失与降低、骨组织微结构破坏、骨脆性增加，导致患者容易出现骨折的全身代谢性骨病[1]，以骨骼疼痛、易于骨折为特征。OP的发病与年龄息息相关，随着社会人口老龄化的加剧，现已经成为影响中老年生活质量的重要原因。我国OP的发生率约为6.6%，总患病人数达6 000～8 000万，居世界之首，男女患病率之比为1∶(2～3)，患者多为60岁以上的老年人以及绝经期后妇女[2]，其中绝经后骨质疏松症(postmenopausal osteoporosis，PMOP)更是严重困扰绝经后5～10年内的女性[3]。

目前，防治PMOP的药物有钙剂、维生素D、降钙素、二膦酸盐、雌激素及异黄酮等[4]。激素代替疗法被认为是治疗PMOP的最佳选择，也是最有效的治疗方法，但存在的问题是激素代替疗法可能会给其他系统带来不良反应，而其他药物也因为不同程度的副作用，难以被广大患者所接受[5]。中医理论认为PMOP的发生主要与肾虚、气血亏虚和肝血不足有关，如今临床上使用中国传统经典方剂治疗PMOP的方法繁多，主要为六味地黄丸、左归丸、右归丸、金匮肾气丸、二至丸、青娥丸等6种方剂[6]。其中青娥丸为补肾强腰壮骨经典名方，最早收录于《太平惠民和剂局方》，由杜仲、补骨脂、核桃仁、大蒜等4味中药组成。目前尚无使用网络药理学验证青娥丸对治疗PMOP作用机制的研究，为此，本研究旨在分析青娥丸的药理作用，从而为临床上使用青娥丸治疗PMOP提供可靠依据。

1 材料与方法

1.1 分析青娥丸的化合物及靶点蛋白

(1)利用TCMSP数据库及BATMAN-TCM数据库筛选出青娥丸其涉及药物的化合物成分，设定化合物收录标准[7]为：口服利用度(OB%≥30%)、类药性(DL≥0.18)；(2)选取每个化合物的前10个Related targets(相关靶点蛋白)上传至PharmMapper数据库，选择物种为“Homo sapiens”，进行潜在靶点蛋白(以下简称“靶点”)识别，其后剔除非人源与不规范的靶点，筛选去重复后数据存档备用。

1.2 分析PMOP的靶点蛋白

通过利用GeneCards、PubMed及CTD数据库，检索疾病关键词“Postmenopausal osteoporosis”，结合3个数据库，收集PMOP的相关靶点，综合数据去重剔除后，筛选出与PMOP相关的发病机制靶点。

1.3 PMOP和青娥丸的共同交集靶点的确定

将PMOP和青娥丸各自的靶点导入Venny 2.1.0平台，得出两者的共同交集靶点，随后将交集靶点上传至STRING 11.0数据库，限定研究物种为“Homo sapiens”，限定置信系数为0.7，进行蛋白互作网络分析。

1.4 GO富集分析及信号通路富集分析

(1)将所得的共同交集靶点上传至David软件，对靶点进行GO的3种功能富集分析，包括生物学过程(biological process，BP)、细胞组成(cellular component，CC)、分子功能(molecular function，MF)；(2)其后利用David软件收集靶点富集的关键KEGG信号通路。其中P<0.05则代表富集结果显著[8]。

1.5 器官定位分析

BioGPS基因信息数据库可以显现靶点在不同组织器官的表达量，以观察靶点在不同组织中的表达差异。将所得的共同交集靶点上传至BioGPS数据库，观察靶点在与PMOP相关器官(肺、肝、心、肾和卵巢)中的表达程度。

1.6 分子对接分析

分子对接主要是研究分子之间(如配体和受体)相互作用，并预测其结合方式和亲合力的一种理论模拟方法。通过使用Cytoscape 3.6.1软件里工具Network Analyzer计算的化合物和靶点的拓扑参数，将计算出的连通度(degree)评估节点排名前10类化合物和前20位靶点上传至iGEMDOCK软件进行分子对接的分析。

2 结果

2.1 青娥丸的方药组成及其药性分类

青娥丸由杜仲、补骨脂、胡桃仁、大蒜4味中药组成，对青娥丸组成药物进行药性分类，可见归经分类上多见于走肾、肺、脾经，功效分类上多见于补虚药，性味分类上多见于温、甘、辛，详见表1。

表1 青娥丸组成药物的药性分类Table 1 Classification of drug properties of Qing’e pill

2.2 青娥丸的化学成分及靶点蛋白

(1)结合TCMSP及BATMAN-TCM两个数据库去重复筛选后，可得到青娥丸有效成分32个，其中杜仲26个，补骨脂4个，胡桃仁1个，大蒜1个，4种中药没有出现共同化合物，详见表2；(2)使用PharmMapper 数据库识别32个化合物的靶点，同时利用Cytoscape 3.6.1软件分析并绘制“中药-化合物-潜在靶点”图，可见4味中药32个化学成分对应100个潜在靶点，详见图1，该图共含有136个节点，其节点大小由拓扑学参数中网络度决定。

表2 青娥丸组成药物的化学成分Table 2 Chemical composition of Qing'e pill

图1 “中药-化合物-潜在靶点”图Fig.1 Diagram of traditional Chinese medicine-compound-potential target

2.3 PMOP的靶点蛋白

检索关键词“Postmenopausal osteoporosis”，分别在GeneCards、PubMed及CTD数据库中收集到靶点1 069个、282个及73个，结合3个数据库，综合数据去重剔除后，得出PMOP的相关发病机制靶点共1 157个。

2.4 PMOP及青娥丸的共同交集靶点及靶点间的相互作用分析

(1)通过Venny软件得出PMOP和青娥丸的共同交集靶点有45个，详见图2；(2)对共同的靶点构建PPI网络，发现靶点之间的相互关系紧密，交织范围广泛，其中杜仲有靶点28个、补骨脂11个、胡桃仁3个、大蒜7个，杜仲中作用靶点数量占交集靶点总数的62%，补骨脂占24%，推测在使用青娥丸治疗PMOP的过程中，杜仲和补骨脂发挥主要作用，这与《方剂学》书中青娥丸里杜仲为君药，补骨脂为臣药的中医药理论思想不谋而合。详见图3(红：杜仲；蓝：补骨脂；绿：胡桃仁；黄：大蒜)。

图2 绝经后骨质疏松症与青娥丸交集靶点的韦恩图Fig.2 Venn map of the intersection target between postmenopausal osteoporosis and Qing’e pill

图3 绝经后骨质疏松症与青娥丸交集蛋白的互作网络图Fig.3 Interaction network diagram of postmenopausal osteoporosis and Qing’e pill

2.5 交集靶点的GO富集分析

45个关键靶点通过David软件进行GO分析，可以看到青娥丸干预PMOP后可能参与了150个生物学过程，其中包括雌激素反应、维生素D代谢过程、雌激素代谢过程等；参与有28个细胞组成，包括细胞核、线粒体、细胞质等；参与38个分子功能，包括酶结合、药物结合、蛋白质结合等。后利用WPS软件的Excel绘制GO富集分析图，详见图4。

图4 青娥丸对PMOP作用靶点富集的GO分析结果图Fig.4 Go analysis results of the concentration of the target of Qing’e pill on PMOP

2.6 交集靶点富集的KEGG-Pathway分析

45个关键靶点通过David软件进行KEGG分析后，可以看到青娥丸干预PMOP后参与的主要信号通路有雌激素信号途径、钙信号通路、cGMP-PKG信号通路等36条，后利用OmicShare平台绘制富集KEGG通路的气泡图，详见图5。

图5 青娥丸对PMOP作用靶点富集的KEGG通路气泡图Fig.5 Bubble diagram of KEGG pathway enriched by the action target of Qing’e pill on PMOP

2.7 交集靶点富集的器官定位分析

45个关键靶点通过BioGPS软件进行器官定位分析，定位结果大于Median(中间值)则表明靶点在该组织器官中的表达量高，后使用Cytoscape 3.6.1软件绘制“器官-靶点”关系图，可见作用于肝、心、肺、肾及卵巢的靶点个数分别为42、40、39、10及4，详见图6。

2.8 主要化合物与主要交集靶点的分子对接分析

Network analysis工具中，化合物及靶点网络中的网络度(degree)越大，说明青娥丸通过该靶点治疗疾病的可能性越大，根据拓扑学参数计算后，40957-99-1、beta-sitosterol和kaempferol等10个主要化合物及PTGS2、HSP90AA1和PTGS1等20个关键靶点的网络度最大，详见表3。将10个主要化合物和20个关键靶点通过iGEMDOCK软件进行分子对接的分析后，得到200个对接结果，对接能量越低，说明两者结合的稳定度可能性越大，使用TBtools软件绘制分子对接数据热图，详见图7，可见靶点CYP3A4和化合物hirsutin_qt的结合度最高，结合力(docking fitness)为-136.804。

表3 青娥丸的化学成分-作用靶点的拓扑学参数

图7 主要化合物和关键靶点的分子对接结果图Fig.7 Molecular docking results of main compounds and key targets

3 讨论

PMOP主要发生在绝经后妇女，是由于雌激素缺乏导致骨量减少及骨组织结构变化，使骨脆性增多，易于骨折的疾病，由骨折引起的疼痛、骨骼变形等症状严重困扰绝经后女性的身体健康和生活质量，甚至缩短寿命。

中医理论认为PMOP的发生主要与肾虚有关，青娥丸4味中药归经分类上多见于走肾经，肾主骨生髓，药物可通过机体作用于肾经发挥其补肾健骨之效；功效分类上多见于补虚药，补虚药可以消除机体因患PMOP日久所致的虚弱证候，以增强体质；性味分类上多见于温、甘，温属阳，可助机体温经通络，味甘补益、可缓急由骨折引起的疼痛；4药配伍同用，可加强其补肾、强筋、健骨之功效。

药理学研究显示青娥丸主要是通过促进骨钙吸收，调节钙与磷间的平衡，从而抑制破骨细胞活动，使骨代谢稳定，并调节雌激素代谢而防治PMOP[9]。本研究表明青娥丸干预PMOP与32个化学成分及100个关键靶点相关，通过主要化合物与主要交集靶点的分子对接分析，发现靶点CYP3A4和化合物hirsutin_qt的结合度最高，CYP3A4(细胞色素P450 3A4)是一种血红素硫氧基化酶，可执行多种氧化反应，故推测hirsutin_qt能够通过与CYP3A4的高度结合，作用于PMOP，以调节机体的氧化反应。而杜仲中的木脂素、苯丙素化学成分可增强免疫作用，补骨脂中的豆甾醇可作为维生素D3的生产原料[10]，由此推测青娥丸可在一定程度上预防PMOP的加重。

在对靶点的GO富集分析过程中，发现靶点参与了150个生物学过程、28个细胞组成及38个分子功能，表明青娥丸干预PMOP的生物功能主要体现在雌激素调节、骨矿化调控、因子结合的调控等方面。而通过靶点富集的通路分析，发现靶点主要涉及钙信号通路、雌激素信号途径、cGMP-PKG信号通路等36条关键效应通路。Wang等[11]通过实验研究表明通过调控钙信号通路能够对成骨的诱导性产生重要影响。任茜[12]使用50 Hz 0.6 mT低频脉冲电磁场照射处理大鼠颅骨成骨细胞，实验结果显示cGMP/PKG信号途径被激活，成骨细胞矿化也变得成熟，由此可以推测cGMP-PKG信号通路与骨形成有密切联系。另有Evellyn等[13]和Liu等[14]实验研究发现刺激雌激素信号途径可调控机体对雌激素的分泌水平。综上推测青娥丸可能通过调控钙信号通路、雌激素信号途径及cGMP-PKG信号通路等关键效应通路对因雌激素减少而导致的骨量丢失状况有所改善。

将靶点导入BioGPS数据库中进行器官定位后发现，定位至心、肝、肺三种脏器的靶点数量最多，同时也有关键靶点定位于与PMOP密切相关的脏器：肾和卵巢，由此可以推测通过青娥丸干预PMOP后，可提高关键靶点蛋白在肾和卵巢组织中的表达量。而青娥丸药物组成中杜仲、补骨脂、胡桃仁三药均入肾经，因此青娥丸可有效改善因久患PMOP而导致的肾虚症状，该结果也与药理学上青娥丸能够补肾健骨，调节雌激素的结论相符。同时在临床治疗研究中，卞庆来等[15]研究表明使用青娥丸干预肾虚型PMOP后，患者的腰背刺痛、腰膝酸软程度均明显降低。另有马陈等[16]使用青娥丸治疗PMOP患者6个月后，发现青娥丸治疗组腰椎、股骨颈骨密度明显高于安慰剂对照组。以上研究也印证了青娥丸干预PMOP的临床疗效与本研究结果相符，进一步佐证了中医学的科学性、系统性。

综上所述，本研究以传统中医药理论为支点，以客观临床治疗为支撑，通过利用分子对接、网络药理学及生物信息学，结合三者的规范化、整体化、系统化的特点，深入研究青娥丸治疗PMOP的作用机制，与中医药整体观与辨证论治的原则不谋而合。本研究揭示青娥丸对治疗PMOP具有明显的药理疗效，同时挖掘了许多潜在的治疗靶标，为下一步深入验证奠定了良好理论基础。目前临床上对青娥丸干预PMOP的治疗效果其证据材料尚且不足，未来仍需进一步行临床研究以探索验证。