卵巢癌患者T细胞、微血管密度与癌细胞转移预后的关系

刘小丽，杨志明，王黎黎，马华，王静

卵巢癌恶性程度极高，临床死亡率位居妇科肿瘤之首，由于早期缺乏典型的临床症状，确诊时多处于中晚期，其术后5年总生存率为25%～35%[1]。寻找可靠、有效的用于临床诊治和辅助判断预后的指标及方法在卵巢癌治疗中显得尤为重要。卵巢癌患者体内T淋巴细胞的含量能够提示机体免疫以及抗肿瘤的状态，对于评价预后有重要的临床意义。微血管的形成为肿瘤的侵袭、转移及生长提供了更多选择性以及机会，为肿瘤细胞的恶性生物学行为提供营养支持，目前有研究发现卵巢癌是具有血管生成力的典型肿瘤之一[2-4]。与非新生血管内皮相比，CD34 抗原于新生血管内皮的表达显著提高，因此本研究选用CD34抗原来标记微血管密度(microvessel density，MVD)[5-6]，并探究T细胞和MVD与卵巢癌细胞转移预后之间的关系。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选择2017年1～12月河北省冀中能源峰峰集团总医院北院区妇产科经过病理确诊的65例卵巢癌患者为卵巢癌组，平均年龄(49.24±15.78)岁。其中年龄≤50岁的30例，>50岁的35例；组织低分级的26例，组织中、高分级的39例；组织类型为浆液性癌37例，子宫内膜样癌20例，其他类型8例；临床分期Ⅰ～Ⅱ期33例，Ⅲ～Ⅳ期32例；远处转移46例，未发生远处转移19例。

另选取术中卵巢组织病理学检测结果为良性的30例为良性卵巢瘤组，平均年龄(48.15±14.98)岁。选取因子宫脱垂、子宫肌瘤等行子宫+卵巢切除术卵巢正常者35例为对照组，平均年龄(49.33±14.98)岁。

所有患者于术前一天统一抽取外周血，手术留取卵巢组织，用浓度为10%的福尔马林进行固定备用。本研究经医院伦理委员会批准，所有患者知情同意。

1.2 纳入排除标准

纳入标准：① 卵巢癌患者由影像和病理双重确诊；② 所有患者均是卵巢癌首次手术治疗患者；③ 此前无手术以及放化疗治疗史；④ 均无精神疾病。排除标准：① 排除复发和转移性卵巢癌；② 患血液系统病；③ 患感染性疾病；④ 心、肝、肾功能受损患者。

1.3 流式细胞仪检测T细胞

采用FACSCantoⅡ型流式细胞仪(美国BD公司)分别对卵巢癌组和对照组的外周血样进行检测，检测血清中CD3+、CD4+、CD8+T淋巴细胞的占比以及计算CD4+/CD8+的比值。

1.4 免疫组化法检测微血管密度

对样本组织制作5 μm厚的石蜡切片，脱蜡后进行热修复和PBS冲洗，封闭后加入CD34一抗，4℃孵育过夜，重复操作再滴加二抗，经过PBS反复冲洗用DAB进行显色，苏木素固色，使用梯度浓度的酒精脱水处理，滴加二甲苯使切片透明，最后使用中性树胶进行封片。 MVD计数方法：每例样本选择5个视野，200倍高倍镜下观察，棕黄色为CD34在血管内皮细胞中的阳性染色，当多个被染色的内皮细胞连成一条管腔时记为一条微血管，计算每例样本的MVD均数为该卵巢癌患者的MVD值。

1.5 预后随访

术后两年内对每例患者进行每3月一次的电话随访，两年后每5个月随访一次，随访截止时间为2020年3月，随访时间为3～39个月。总生存期(overall survival，OS)即为手术之日起至患者死亡或者随访结束的月数。

1.6 统计学方法

2 结果

2.1 卵巢癌组与对照组T细胞比较

卵巢癌组患者的血清中T淋巴细胞CD3+、CD4+的百分比含量以及CD4+/CD8+的比值较对照组低，CD8+的百分比含量较对照组高，差异有统计学意义(P<0.05)，详见下页表1。

表1 卵巢癌组与对照组T细胞比较

2.2 各组卵巢组织微血管密度比较

卵巢癌组、良性卵巢瘤组、对照组的卵巢组织MVD比较[(50.01±2.32)、(22.56±1.20)、(7.89±3.11)]，差异有统计学意义(F=43.122，P<0.05)。卵巢癌组和良性卵巢瘤组的MVD较对照组高(t=2.311，3.534，P<0.05)；卵巢癌组较良性卵巢瘤组的MVD高，差异均有统计学意义(t=5.276，P<0.05)。

2.3 卵巢癌患者血清T细胞、组织微血管密度与病理特征关系

在不同组织类型卵巢癌患者中，血清T细胞以及组织MVD的差异无统计学意义(P>0.05)；卵巢癌患者年龄≤50岁较>50岁患者T淋巴细胞CD3+、CD8+的含量差异无统计学意义(P>0.05)，年龄>50岁的患者较年龄≤50岁者CD4+和CD4+/CD8+的比值降低，MVD上升(P<0.05)；组织高分级的卵巢癌患者较组织低分级的患者CD3+、CD4+和CD4+/CD8+上升，CD8+和MVD降低(P<0.05)；临床分期Ⅰ～Ⅱ期较Ⅲ～Ⅳ期的患者CD3+、CD4+和CD4+/CD8+上升，CD8+和MVD降低(P<0.05)；癌细胞远处转移的卵巢癌患者较未转移患者的CD3+、CD4+和CD4+/CD8+降低，CD8+和MVD上升(P<0.05)，详见表2。

表2 卵巢癌患者血清T细胞、组织微血管密度与病理特征关系

2.4 卵巢癌患者T细胞水平、微血管密度与预后关系

以T淋巴细胞CD3+细胞的水平高低来表示卵巢癌患者T细胞水平的高低，可知T细胞高水平组患者的中位OS为33.00个月，较T细胞低水平患者OS 20.50个月显著上升(P<0.05)；MVD低表达的卵巢癌患者术后中位OS为38.00个月，较MVD高表达的卵巢癌患者22.00个月显著升高(P<0.05)。详见下页图1。

注：A图代表T细胞水平分组；B图代表MVD水平分组。

2.5 卵巢癌患者预后影响因素分析

单因素分析显示，临床分期Ⅲ～Ⅳ期、T细胞低水平及MVD高水平是影响卵巢癌患者预后的危险因素(P<0.05)；多因素分析显示，临床分期Ⅲ～Ⅳ期、T细胞低水平以及MVD高水平是影响卵巢癌患者预后的独立危险因素(P<0.05)，详见表3，表4。

表3 影响卵巢癌患者预后的单因素分析

表4 影响卵巢癌患者预后的多因素分析

3 讨论

卵巢癌的的主要特点为早期难确诊、高恶性、易转移、手术彻底治愈率低以及易出现耐药性，故其死亡率在生殖系统恶性肿瘤疾病中位居前列。阻止癌细胞的转移是防止卵巢癌肿瘤恶性程度进一步加深的关键性举措，探究影响患者手术预后的相关因素也是为患者术后争取更多生存时间的重要突破口。研究表明，肿瘤的发生发展其本质是与免疫调节系统互相影响和作用的结果，机体的免疫状态紊乱与癌细胞的增殖、侵袭和卵巢癌发展预后存在着紧密的联系[7]。免疫T细胞是人体免疫系统发生反应的重要参与部分，细胞免疫相关指标的检测对于评估肿瘤发展预后有重要的临床价值[8]。常用T细胞亚群检测评价免疫功能，CD3+的水平代表机体整体细胞免疫的水平高低，CD4+作为辅助性T细胞的重要标志能够通过刺激其他淋巴细胞参与免疫反应，并辅助调控其他细胞发挥功能，CD8+能够对细胞免疫和抗体的形成负向调节，健康者血清中CD4+和CD8+的比值处于动态平衡的状态，有研究发现肿瘤发展过程中CD8+经诱导刺激会有所增多[9]，CD4+和CD8+的比值发生显著改变，免疫平衡被打破，对卵巢癌患者的疾病发展和身体恢复都会产生影响[10-13]。临床试验以及动物试验证实，肿瘤在失去血管提供营养后最大能够长至2 mm就不再生长，肿瘤微血管为肿瘤的生长及侵袭均提供了营养支持。肿瘤微血管长度与细胞分裂增殖的速度成反比，说明MVD对于肿瘤生长起着决定性的作用，没有微血管系统的营养支持，肿瘤组织生长将会静止停滞，体积增长受限。本试验主要研究T细胞、MVD与癌细胞转移预后的关系。

本研究发现，卵巢癌患者CD3+、CD4+的百分比含量以及CD4+/CD8+的比值较健康者显著降低，CD8+的百分比含量显著升高，说明卵巢癌患者的机体免疫功能较健康者显著下降，提高机体免疫功能对于卵巢癌的疾病转归有重要的意义。卵巢癌和良性卵巢瘤组织中的MVD较正常卵巢组织中显著上升，卵巢癌组织较良性卵巢瘤组织中的MVD显著上升，说明肿瘤组织MVD会随着病理组织的恶性程度增加而变大，进一步验证了微血管为肿瘤生长及恶性生物学行为提供营养支持的说法，提示抑制肿瘤微血管生成也是治疗该病的关键。卵巢癌患者年龄≤50岁与>50岁患者T淋巴细胞CD3+、CD8+的含量比较，差异无统计学意义，年龄>50岁的患者较年龄≤50岁者CD4+和CD4+/CD8+的比值显著降低，MVD显著上升，说明随着年龄的增大，机体免疫系统的不稳定因素增多导致免疫功能出现紊乱。组织中高分级、临床分期Ⅰ～Ⅱ期较组织低分级、Ⅲ～Ⅳ期的患者CD3+、CD4+和CD4+/CD8+显著上升，CD8+和MVD显著降低，说明卵巢癌的发展越到后期，患者的免疫功能越弱，组织微血管的密度越大，并且可能形成这种免疫功能降低、MVD增加促进卵巢癌疾病发展的恶性循环。癌细胞远处转移的卵巢癌患者较未转移患者的CD3+、CD4+和CD4+/CD8+显著降低，CD8+和MVD显著上升。T细胞高水平组患者的中位OS较T细胞低水平患者OS 显著上升；MVD低表达的卵巢癌患者术后中位OS较MVD高表达的卵巢癌患者显著升高。说明患者免疫功能降低和MVD增大促进卵巢癌细胞的转移以及提示患者的不良预后。多因素分析显示：临床分期Ⅲ～Ⅳ期、T细胞低水平以及MVD高水平是影响卵巢癌患者预后的独立危险因素(P<0.05)，这一结论为卵巢癌的预后危险因素排除提供了方向。

综上所述，卵巢癌患者T细胞、MVD与癌细胞转移及预后关系密切，有望用于卵巢癌临床治疗方案选择及预后评估。