SOCS1调控JAK/STAT通路传导抑制肝癌细胞增殖、侵袭、迁移的机制研究

邓桢，雷钊，朱红伟，李志强，余枭，杨智，孙吉春，金晓馨

(1.中南大学湘雅三医院肝胆胰外科， 湖南长沙 410013； 2.中南大学湘雅医院结直肠肛门外科，湖南长沙 410008；3.中南大学湘雅二医院胃肠外科，湖南长沙 410011)

肝癌是全球范围内最常见的致命恶性肿瘤，据统计，2020年全球新增肝癌患者905 677例，死亡病例830 180例[1]。肝癌具有隐匿性，患者发病时通常被诊断为肝癌晚期，由于侵袭性较强、复发率高，导致其预后不良，目前对于肝癌患者，早期治疗以根治性切除为主，但50%的术后患者在5年内出现转移和复发[2-3]。近年来，细胞因子信号转导抑制因子(suppressors of cytokine signalling， SOCS)表达变化被报道与多种疾病和癌症的发生发展密切相关[4]。SOCS家族重要成员SOCS1基因可由多种细胞因子和生长因子诱导，并以负反馈方式抑制其信号传导，进而发挥抗肿瘤作用[5-6]。有研究表明SOCS1基因在肝癌组织中的表达水平显著低于正常组织，且SOCS1在肝细胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)中的表达具有独立的预后价值[7-8]，然而SOCS1在肝癌进展中的功能及分子机制尚未明确。本研究旨在探讨SOCS1表达变化对肝癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响，并初步揭示SOCS1在抑制肝癌发生发展中的作用机制，希望在探讨SOCS1抑制肝癌进展机制的同时，能够为临床治疗肝癌寻找新的分子靶标和治疗靶点提供新的切入点。

1 材料与方法

1.1 主要试剂

DMEM培养基购置于美国Thermo Fisher Scientific公司，胎牛血清(fetal bovine serum, FBS)购自Gibco公司。RNA提取试剂盒、蛋白质提取试剂盒、BCA试剂盒购自上海碧云天公司，反转录试剂盒、SYBR green qRT-PCR试剂盒购自日本Takara公司。Anti-SOCS1(ab)、Anti-JAK2(ab108596)、Anti-p-JAK2(ab32101)、Anti-STAT3(109085)、Anti-p-STAT3(ab76315)、GADPH抗体、羊抗、兔二抗均购自美国Abcam公司。

1.2 细胞培养及转染

人正常肝细胞HL-7702购自美国生物资源保藏中心(American Type Culture Collection, ATCC)；肝癌细胞系HepG2和Hep3B购自中国科学院细胞库； HuH-7细胞系购自日本科研生物资源细胞库。使用添加100 U/ml链霉素/青霉素和10%(v/v)胎牛血清(FBS)的DMEM培养基，温度37℃，含5% CO2环境培养细胞。由上海吉玛公司合成pcDNA3.1-SOCS1，pcDNA3.1-siRNA-SOCS1实现SOCS1的过表达或干扰表达。

1.3 MTT实验检测细胞增殖能力

收集对数期细胞接种于96孔细胞培养板， 调整细胞悬液浓度为5×105个/ml，每孔加入100 μl细胞悬液培养， 待贴壁后48 h加入MTT溶液(5 mg/ml) 20 μl，孵育4 h，弃培养液，加150 μl的DMSO，振荡10 min；检测波长490 nm下的OD值，计算细胞增殖活性。

1.4 RNA提取及qRT-PCR分析

选择对数生长期的细胞，使用RNase free PBS洗涤，加入Trizol溶液，室温放置5 min使细胞充分裂解，12 000 rpm、4℃离心10 min，取澄清上清液，加入三氯甲烷室温静置3～5 min，4℃下12 000 rpm离心15 min，取上清液加入异丙醇，室温静置10 min后4℃下12 000 rpm离心10 min，75%乙醇洗涤2次，提取细胞的总RNA，使用反转录试剂盒将总RNA反转录为cDNA，然后通过SYBR green qRT-PCR试剂盒检测SOCS1，JAK2和STAT3的mRNA水平，qRT-PCR分析采用7500HT qRT-PCR系统。

1.5 Western blot检测相关蛋白的表达情况

将对数生长期的细胞用细胞裂解液裂解，转速13 000 rpm 4℃，离心30 min，取上清液提取总蛋白，用BCA法测定蛋白浓度，然后100℃水中煮5 min使蛋白变性。放置冰上3 min，13 000 rpm，4℃离心15 min。12%SDS-PAGE浓缩胶进行蛋白分离，电泳结束后，将胶中的蛋白湿转至PVDF膜，加含5%(w/v) 脱脂奶粉的TBS/T封闭缓冲液， 摇床封闭2 h。回收封闭液加入相应一抗(4℃孵育过夜)，然后使用TBST冲洗膜后加入二抗，最后进行蛋白质条带显色检测。使用GAPDH作为内源性对照。

1.6 细胞划痕实验检测细胞迁移能力

将各组细胞以浓度为5×105个/ml接种于细胞培养板上，第二天使用枪头在每个孔上划出一条直线，用PBS洗细胞3次，去除划下的细胞，加入无血清培养基。放入37℃ 5%CO2培养箱进行培养。在0 h，24 h和48 h时取样拍照，在光学显微镜下观察细胞的迁移距离。

1.7 Transwell实验检测细胞侵袭能力

用50 mg/L Matrigel 1∶8稀释液包被Transwell小室底部膜的上室面，4℃风干。将小室放入培养板中，在上室加入300 μl预温的无血清培养基，室温静置15～30 min，使基质胶再水化，再吸去剩余培养液。 使用胰酶消化细胞，终止消化后离心弃去培养液，用PBS洗1～2遍，用含BSA的无血清培养基重悬，调整细胞密度至5×105，取细胞悬液100 μl加入Transwell小室，常规培养48 h，使用结晶紫染色20 min后，轻轻擦掉上层未迁移细胞，检测穿过的细胞数。

1.8 统计学方法

2 结 果

2.1 SOCS1在肝癌细胞系中低表达

收集和培养人正常肝细胞HL-7702和肝癌细胞系HepG2，HuH7，Hep3B， qRT-PCR和Western blot检测SOCS1在各细胞系中的表达水平。结果如图1所示，相较于人正常肝细胞HL-7702，SOCS1 mRNA和蛋白表达水平在肝癌细胞系HepG2、HuH7、Hep3B中均显著下调(P<0.01)，其中HepG2下调最为显著(见图1)。

图1 SOCS1在人肝癌细胞系中低表达(A，qRT-PCR检测人正常肝细胞和肝癌细胞系中SOCS1 mRNA表 达水平； B， Western blot检测人正常肝细胞和肝癌细胞系中SOCS1蛋白表达水平， ** P<0.01)

2.2 SOCS1抑制肝癌细胞增殖、迁移、侵袭

通过pcDNA-SOCS1和pcDNA-si-SOCS1及空载体对照转染肝癌细胞HepG2，构建SOCS1过表达和干扰表达的肝癌细胞系，用于后续实验。MTT实验检测SOCS1表达变化对肝癌细胞增殖活性的影响，结果显示SOCS1过表达可显著降低肝癌细胞增殖活性，而SOCS1干扰表达则显著增强细胞增殖活性(P<0.01)。细胞划痕实验结果显示，SOCS1过表达组肝癌细胞24 h、48 h迁移距离显著降低，且1/2划痕愈合时间增长，而SOCS1干扰表达组24 h、48 h迁移距离显著上升，1/2划痕愈合时间缩短(P<0.01)。Transwell实验结果显示SOCS1过表达能够显著抑制肝癌细胞侵袭，SOCS1干扰表达则显著促进细胞侵袭(P<0.01)(见图2)。

图2 SOCS1抑制肝癌细胞增殖、 迁移和侵袭(A， qRT-PCR和Western blot检测SOCS1过表达/干扰表达载体转染效 率； B， MTT实验检测SOCS1表达变化对肝癌细胞增殖活性的影响； C, 细胞划痕实验检测SOCS1表达变化对 肝癌细胞迁移能力的影响； D， transwell实验检测SOCS1表达变化对肝癌细胞侵袭能力的影响，** P<0.01)

2.3 SOCS1通过影响JAK2和STAT3磷酸化水平调控JAK/STAT信号通路活性

进一步检测SOCS1表达变化对JAK/STAT信号通路的影响，结果如图3。qRT-PCR检测结果显示SOCS1干扰表达或过表达后肝癌HepG2细胞中JAK/STAT通路相关蛋白JAK2和STAT3 mRNA均无显著变化。Western blot检测JAK2和STAT3蛋白表达水平和磷酸化水平，结果显示SOCS1表达变化不影响JAK2和STAT3蛋白表达水平，磷酸化水平检测结果显示SOCS1干扰表达可显著上调JAK2和STAT3磷酸化水平，而SOCS1过表达显著下调JAK2和STAT3磷酸化水平，表明SOCS1能够影响肝癌细胞中JAK/STAT信号通路的活性。

图3 SOCS1调控JAK/STAT信号通路活性 (A， qRT-PCR检测SOCS1表达变化对JAK2mRNA水 平的影响； B， qRT-PCR检测SOCS1表达变化对STAT3 mRNA水平的影响； C， Western blot 检测SOCS1表达变化对JAK2、 STAT3蛋白表达水平和磷酸化水平的影响， ** P<0.01)

2.4 SOCS1通过调控JAK/STAT信号通路影响肝癌细胞增殖、迁移和侵袭

SOCS1和JAK/STAT通路抑制剂氯硝柳胺共处理肝癌细胞HepG2，MTT实验结果显示干扰SOCS1表达后细胞增殖活性显著上升， 而氯硝柳胺处理则能抑制SOCS1干扰表达对肝癌细胞增殖的影响(P<0.01)。细胞划痕实验结果显示si-SOCS1和氯硝柳胺共处理组肝癌细胞迁移速度显著下降，1/2划痕愈合时间显著增加(P<0.01)。Transwell实验结果表明si-SOCS1和氯硝柳胺共处理能够显著抑制肝癌细胞侵袭能力(P<0.01)。以上结果提示，SOCS1能够通过调控JAK/STAT信号通路影响肝癌细胞生长。

图4 SOCS1通过调控JAK/STAT信号通路影响肝癌细胞的生长 (A， MTT实验检测si-SOCS1和JAK/STAT通路抑制剂细胞增殖活性的影响； B， 细胞划痕实验检测si-SOCS1和氯硝柳胺共处理对肝癌细胞迁移能力的影响；C， transwell实验检测肝癌细胞si-SOCS1和氯硝柳胺共处理对肝癌细胞侵袭能力的影响，**P<0.01)

3 讨 论

肝癌是全球面临的一个重大的公共卫生挑战，严重威胁人类生命健康，在所有肝癌病例中，90%患者为HCC。目前，肝癌的治疗主要以根治性切除、化疗及免疫治疗为主，然而疗效均不理想，且预后较差[2,9]。因此，寻找新的分子靶标和治疗靶点，开发新的靶向治疗特效药物及治疗方法是目前亟待解决的问题。

研究表明，SOCS家族与多种癌症和肿瘤进展相关，特别是SOCS1和SOCS3[10]。鉴于SOCS1在多种癌症中的低表达，在癌组织中检测SOCS1蛋白表达水平是评估SOCS1作为潜在癌症生物标记物的直接方法。本研究检测SOCS1在人正常肝细胞和各种肝癌细胞系中的表达差异，结果显示SOCS1在3种肝癌细胞系中均显著低表达，结果与先前的文献报道一致[7]。SOCS1被发现与多种疾病和肿瘤的发生发展及预后密切相关，如，前列腺切除样本中SOCS1蛋白表达变化可能和前列腺癌预后相关，并且SOCS1可能作为与远处转移相关的血清生物标志物，成为前列腺癌个性化治疗的靶点[11]；卵巢癌中SOCS1 mRNA的低甲基化率增加了SOCS1 mRNA的表达，从而促进卵巢癌的发生发展[12]；SOCS1可通过抑制Toll样受体(Toll-like receptor, TLR)通路促进糖尿病性肾病(diabetic nephropathy, DN)大鼠肾损伤修复[13]等。SOCS1基因可能成为未来肿瘤治疗的新靶点，为肿瘤治疗和预后评价提供新的希望，然而SOCS1在肝癌中作用机制的研究报道较少，且都局限于SOCS1在病灶组织中的表达检测及其在免疫调节中的作用，如，丙型肝炎病毒(hepatitic C virus, HCV)患者SOCS1基因表达与血红蛋白(hemoglobin, Hb)和血小板计数呈正相关，而与白细胞数与其表达情况呈负相关[14]；SOCS1基因甲基化状态可能在肝癌发生过程中发挥重要作用，SOCS1结合血清甲胎蛋白(alpha fetoprotein, AFP)可作为HCC诊断和预后的非侵袭性生物标志物[15]。SOCS1是否能对肝癌细胞的生长产生影响，进而控制肝癌的进展，仍需要通过研究来验证。本研究通过在肝癌细胞中过表达或干扰表达SOCS1，检测SOCS1表达变化对肝癌细胞生长的影响，结果显示过表达SOCS1能够显著抑制肝癌细胞的增殖、迁移和侵袭，而干扰表达SOCS1则结果相反，证实了SOCS1在肝癌中的抑癌作用。

SOCS1是经典的Janus激酶/信号转导与转录激活子(the Janus kinase/signal transducer and activator of transcription, JAK/STAT)信号通路的抑制剂，研究表明SOCS1可以靶向未磷酸化的JAK，SOCS1的激酶抑制区域可高特异性靶向结合JAK的底物结合槽，从而通过阻止JAK的磷酸化来抑制信号传导[16]。SOCS1/JAK/STAT途径也在多种疾病中表现出调控作用，如，靶向SOCS1可通过抑制JAK/STAT信号通路减轻糖尿病患者的肾脏和血管氧化应激[17]；抑制SOCS1可促进JAK/STAT信号通路的持续激活，并启动与增殖和侵袭相关基因的转录，促进鼻咽癌的恶性进展[18]；SOCS1基因甲基化导致SOCS1基因沉默，影响了SOCS1对下游JAK2/STAT信号通路的抑制，从而促进急性髓系白血病细胞的生长和增殖[19]。虽然目前SOCS1/JAK/STAT途径在肝癌中作用尚未见报道，但有研究显示，Ⅲ型干扰素可通过诱导SOCS1的表达，延迟和延长JAK/STAT信号通路的激活，在HCV患者治疗中发挥重要作用[20]。本研究结果显示SOCS1能够通过调控JAK/STAT信号通路活性，影响肝癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力，提示SOCS1介导的JAK/STAT信号通路调控肝癌进展的可能性。并且JAK/STAT通路抑制剂处理能够恢复SOCS1表达变化对肝癌细胞的影响，进一步证实了SOCS1是通过介导JAK/STAT信号通路影响肝癌细胞的生长。

综上所述，本研究表明SOCS1在肝癌中能通过影响JAK2和STAT3磷酸化水平调控JAK/STAT信号通路的活性，进而抑制肝癌细胞的增殖、迁移和侵袭，为临床治疗肝癌寻找新的分子靶标和治疗靶点提供新的切入点。