鹰嘴豆芽素A诱导人成骨肉瘤MG63细胞凋亡作用研究△

黄 乾，廖世杰，林成森，刘 云，李波香，陈县祥，刘建宏，丁晓飞*

（广西医科大学第一附属医院a:骨科；b:广西再生医学研究中心，广西南宁530021）

骨肉瘤是最常见的原发性骨肿瘤，儿童、青少年 好发［1］。骨肉瘤是高度侵袭性和破坏性的肿瘤，疾病早期易发生周围的骨骼和血管转移［2］。虽在应用新辅助化疗后，非转移性骨肉瘤患者的生存率有一定改善，但复发或转移患者5年生存率仍低于33%；并且常规化疗常存在严重副作用［3～5］。而近20年来骨肉瘤患者的长期生存时间并没有明显的提升［6］。

雌激素可通过调控成骨细胞凋亡来维持骨密度稳定［7］。有研究表明，17β-雌二醇（E2）对骨肉瘤细胞的增殖、迁移、侵袭和凋亡具有调控作用［8］。但长期或大量应用雌激素会带来副作用。分子研究表明，植物雌激素在结构上类似于17β-雌二醇（E2），并且可以结合和激活细胞内雌激素受体，只引起轻微副作用［9］。植物雌激素可抑制多种肿瘤细胞［10］。鹰嘴豆芽素A（biochanin-A,BA），是源于豆科植物鹰嘴豆、红车轴草等的一种异黄酮，具有类雌激素作用［11］。鹰嘴豆芽素A具有多种药理作用。然而，其对人骨肉瘤细胞的作用研究中较少涉及。本项研究主要探索鹰嘴豆芽素A对MG-63人成骨肉瘤细胞的细胞毒性作用及诱导凋亡机制。

1 材料与方法

1.1 实验细胞与处理

1.1.1 细胞培养

MG-63细胞购自中国科学院上海生物化学与细胞生物学研究所细胞库。MG-63细胞使用含10%胎牛血清、1%100 U/ml青霉素和100 U/ml链霉素（四季青，杭州，中国）的高糖DMEM（Gibco,Life Tech⁃nologies,美国）培养基，置于37℃、5% CO2温箱中培养，使用Trypsin+EDTA消化传代。

1.1.2 主要试剂

鹰嘴豆芽素A购自中国上海Aladdin公司；MTT［3-（4，5-二甲基噻唑-2）-2，5-二苯基四氮唑溴盐］购自美国Sigma-Aldrich公司；Annexin V-FITC/PI凋亡检测试剂盒购自美国BD Pharmingen公司；DAPI核酸染色试剂盒购自中国北京Solarbio公司；兔单克隆抗体phospho-p38 MAPK（Thr180/Tyr182）、p38 MAPK（D13E1）、phospho-p44/42MAPK（ERK1/2） （Thr202/Ty204） 、 p44/42 MAPK （Erk1/2）（137F5）、 Phospho-SAPK/JNK （Thr183/Tyr185）、Caspase-3 （8G10）、Cleaved Caspase-9 （Asp330）、PARP （46D11）、Bax （D2E11）、Bcl-2 （D55G8）、β-Actin（D6A8）和辣根过氧化物酶标记的二抗购自美国Cell Signaling Technology公司；重组兔单克隆抗体 Anti-JNK1+JNK2+JNK3 antibody（EPR18841-95）购自英国Abcam公司。

1.2 检测指标

1.2.1 MTT检测

将MG-63细胞［（6～8）×104/ml］接种于96孔板，进入对数期后用鹰嘴豆芽素A（0、2.5、5、10、20、40、80、160 μmol/L）在恒温培养箱中培养 24 h 和 48 h。将 MTT（20 μl，5 mg/ml）加入到每个孔中。于37℃避光温育2 h后，向各孔中加入150 μl二甲基亚砜（DMSO）。使用酶标仪（Spectramax Plus 384,Molecular Devices,美国）在570 nm处获得吸光度。每个浓度梯度设置6个复孔，实验总体重复3次。细胞活性表示为半数抑制浓度（IC50）值。

1.2.2 荧光显微镜观察

用DAPI染色评估核形态的变化。将MG-63细胞（7.5×104/ml）接种在6孔板中，并加入鹰嘴豆芽素 A（0、40、80 μmol/L）处理 24 h。PBS 洗涤后在4%多聚甲醛中固定20 min，并于室温用10 μg/ml DAPI染料染色10 min。使用荧光显微镜观察随机视野中捕获的细胞核形态。

1.2.3 流式细胞检测

取MG-63细胞（1.0×105/ml）接种在6孔板中，用鹰嘴豆芽素A（0、40、80 μmol/L）处理MG-63细胞48 h，PBS洗涤两次，然后以600 g离心5 min。去除上清液，将500 μl的1X结合缓冲液加入到细胞中。向细胞中加入Annexin V（FITC,5 μl）和碘化丙啶（PI,5 μl），然后避光孵育15 min。在1 h内通过BD Accuri C6流式细胞仪（Becton＆Dickin⁃son Co.，美国）测定细胞凋亡率。

1.2.4 Western印迹分析

用鹰嘴豆芽素 A（0、20、40、80 μmol/L）处理MG-63细胞24 h，总蛋白质从MG-63细胞中提取，BCA法检测总蛋白。将等量的蛋白质（40 μg）加入10%～15%十二烷基硫酸钠（SDS）-聚丙烯酰胺凝胶（PAGE）中电泳，然后直接将蛋白转移到NC膜上。将膜在5XBSA溶液中室温封闭1 h；用特异性抗体 p-p38、p38、p-JNK、JNK、p-ERK1/2、ERK1/2、β-Actin、Bcl-2、Bax、caspase-3、caspase-9 和PARP在4℃孵育过夜。洗膜后用辣根过氧化物酶标记的相应二抗室温孵育1 h。使用ChemiDOC™XRS+系统（Bio-Rad Laboratories,美国）检测免疫复合物。

1.3 统计学方法

使用 GraphPad Prism（版本 7.0,GraphPad Soft⁃ware,美国）进行统计分析。结果以平均值±平均值的标准误差（SEM）给出。单因素方差分析（ANO⁃VA）用于比较3个或更多组。P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 鹰嘴豆芽素A抑制MG-63细胞的活性

将人骨肉瘤MG-63细胞用不同浓度的鹰嘴豆芽素 A（0、2.5、5、10、20、40、80 μmol/L）处理 24 h和48 h后使用MTT法测量。MG-63细胞的IC50值在 24 h 为 106.70 μmol/L，48 h 为 75.57 μmol/L。细胞活性显着下降，并呈时间和剂量依赖性效应（图1）。

图1 MTT实验结果表明鹰嘴豆芽素A可抑制MG-63细胞活性，并呈时间和剂量依赖性效应

2.2 鹰嘴豆芽素A诱导MG-63细胞凋亡

用不同浓度鹰嘴豆芽素A（0、40、80 μmol/L）处理MG-63细胞24 h，DAPI荧光染色后使用荧光显微镜观察。在×200视野下，可明显观察到早期凋亡的MG-63细胞，并随着鹰嘴豆芽素A浓度的增加，细胞量较正常组少，凋亡细胞比例较正常组增多（图2a～2f）。

用不同浓度鹰嘴豆芽素A（0、40、80 μmol/L）处理MG-63细胞48 h，用流式细胞仪检测细胞凋亡率，显示凋亡率以剂量依赖方式增加。与正常组相比，使用40 μmol/L和80 μmol/L鹰嘴豆芽素A处理MG-63细胞明显促进其凋亡。当鹰嘴豆芽素A浓度为40 μmol/L和80 μmol/L时，细胞凋亡率分别为（45.28±3.79）%和 （82.51±5.23）%，高于正常组（5.31±3.14）%（P<0.001；P<0.001）（图 2g～2i）。

图2 鹰嘴豆芽素A诱导MG-63细胞凋亡 2a～2f:不同浓度鹰嘴豆芽素A处理后，DAPI染色观察凋亡MG-63细胞核形态改变（倒置显微镜，×200），凋亡细胞核染色质致密深染（如白色箭头所示）（2a:正常组，2b:40 μmol/L鹰嘴豆芽素A，2c:80 μmol/L鹰嘴豆芽素A，2d～2f:分别对应2a～2c的局部放大区域） 2g～2i:Annexin V/PI双染法流式细胞术结果表明鹰嘴豆芽素A诱导MG-63细胞凋亡（2g:正常组，2h:40 μmol/L鹰嘴豆芽素A，2i:80 μmol/L鹰嘴豆芽素A）

2.3 鹰嘴豆芽素A促进MAPK通路的磷酸化p38、磷酸化JNK与磷酸化ERK1/2的表达

用不同浓度鹰嘴豆芽素 A（0、20、40、80 μmol/L）处理MG-63细胞24 h，使用Western blot检测发现，鹰嘴豆芽素A可促进磷酸化p38蛋白的表达，呈剂量依赖方式。鹰嘴豆芽素A也可促进磷酸化JNK蛋白与磷酸化ERK1/2蛋白的表达，以80 μmol/L最明显（图 3a，3b）。

图3 Western blot检测鹰嘴豆芽素A促进MG-63细胞MAPK信号通路相关蛋白表达 3a:鹰嘴豆芽素A促进MG-63细胞磷酸化p38蛋白、磷酸化JNK蛋白与磷酸化ERK1/2蛋白的表达 3b:相对蛋白表达水平统计分析结果（*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001）

2.4 鹰嘴豆芽素A可调控Bcl-2蛋白家族的表达

用不同浓度鹰嘴豆芽素 A（0、20、40、80 μmol/L）处理MG-63细胞24 h，使用Western blot检测主要凋亡途径蛋白Bcl-2蛋白家族中Bax和Bcl-2基因和蛋白的表达。结果显示：鹰嘴豆芽素A以剂量依赖方式上调Bax和下调Bcl-2的表达（图4a，4b）。

2.5 鹰嘴豆芽素A可促进caspase蛋白家族的表达

用不同浓度鹰嘴豆芽素 A（0、20、40、80 μmol/L）处理MG-63细胞24 h，使用Western blot检测主要凋亡途径蛋白caspase蛋白家族。结果显示：随着鹰嘴豆芽素A浓度的增加，cleaved caspase-9、cleaved caspase-3和cleaved PARP的表达增加（图4a，4b）。

图4 Western blot检测鹰嘴豆芽素A促进MG-63细胞凋亡相关蛋白的表达 4a:鹰嘴豆芽素A促进MG-63细胞凋亡相关蛋白的表达 4b:相对蛋白表达水平统计分析结果（*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001）

3 讨论

骨肉瘤严重威胁全球年轻人的健康成长，探索新的骨肉瘤治疗策略十分重要。本研究结果显示鹰嘴豆芽素A以时间和剂量依赖效应来抑制MG63细胞的活性，并通过激活p38、JNK信号通路和主要凋亡信号通路Bcl-2家族和caspase家族来诱导细胞凋亡。

细胞凋亡被广泛认为是一个关键的生理过程，是一种细胞内基因和相关蛋白发挥作用引起的程序性细胞死亡。细胞死亡或凋亡的失常可导致癌症发生［12］。核质浓缩、核膜核仁破碎为细胞凋亡典型形态学表现［12］。本研究通过DAPI染色，观察MG-63细胞核的形态学变化。结果显示鹰嘴豆芽素A可诱导MG-63细胞凋亡，并呈浓度依赖效应。使用An⁃nexin V-FITC和PI染色检测细胞凋亡后，发现随着鹰嘴豆芽素A的浓度增高，MG-63细胞的凋亡率增高。

丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号通路在癌症的发生发展起重要作用［13］。JNK和p38通路为MAPK通路的重要部分，与凋亡密切相关［14］。Chen等［15］证实植物雌激素DDTD可通过激活p38信号通路诱导骨肉瘤细胞的凋亡。Modrowski等［16］证实过表达syndecan-2可活化p38和JNK通路诱导骨肉瘤细胞凋亡。本研究通过Western blot实验检测MAPK信号通路相关蛋白，显示鹰嘴豆芽素A可上调磷酸化p38，磷酸化JNK和磷酸化ERK1/2的表达。

Bcl-2家族中的促凋亡和抗凋亡基因相互影响来维持细胞平衡［17］。Bcl-2是公认的与肿瘤发生相关的抗凋亡因子。组织和器官中的促凋亡因子Bax在线粒体外膜上广泛表达。Bcl-2和Bax的相互拮抗对肿瘤细胞凋亡的调控起重要作用。线粒体通路为细胞凋亡主要通路之一［18］。在启动阶段，线粒体释放细胞色素 C激活 caspase家族，引发级联反应［19］。Cho等［20］研究表明，鹰嘴豆芽素A可以通过上调Bax，下调 Bcl-2，促进 cleaved caspase-9、cleaved cas⁃pase-3和cleaved-PARP的表达来诱导咽鳞癌细胞凋亡。本研究通过Western blot实验证实，鹰嘴豆芽素A通过下调Bcl-2和上调Bax的表达诱导骨肉瘤细胞凋亡。同时检测到凋亡相关蛋白cleaved caspase-9、cleaved caspase-3和cleaved-PARP随着鹰嘴豆芽素A浓度的增加而增加，提示鹰嘴豆芽素A可诱导人成骨肉瘤细胞凋亡。

总之，植物雌激素鹰嘴豆芽素A可以抑制人成骨肉瘤MG-63细胞的活性，并通过激活MAPK/凋亡信号通路诱导细胞凋亡。其可以作为治疗骨肉瘤的一种潜在的新药物。但鹰嘴豆芽素A其他的抗肿瘤机制仍未完全明确，仍需更深层次的多方面探讨。