MiR-155及其靶基因MMP16在反复植入失败患者子宫内膜中的表达*

李伟伟，于涛，刘聪，董丽霞，李刚，闫娅妮，殷秀荣（.秦皇岛市妇幼保健院生殖医学科，河北秦皇岛066004；.潍坊医学院生命科学与技术学院，山东潍坊6053）

随着辅助生殖技术的发展，优质胚胎的利用率和临床妊娠率已得到提升，但是有些优质胚胎仍未能着床。胚胎成功植入子宫内膜主要有几方面影响因素：胚胎因素、子宫内膜的容受性以及胚胎和内膜之间的同步性［1］。子宫内膜的容受性对于胚胎的成功植入起关键作用。研究表明，2/3的反复植入失败（repeated implantation failure，RIF）患者是由于内膜的不容受性引起的［2］。近年来，子宫内膜的容受性成为学者的研究热点。miRNA是一种非编码RNA，结构高度保守，长约20个核苷酸，存在于多种组织和细胞，是一种转录后水平调控基因表达的转录后调节因子。研究表明，miRNA参与胚胎着床、子宫内膜异位症、反复种植失败、复发性流产等过程［3-7］，影响着胚胎黏附、植入、子宫内膜蜕膜化等多种与子宫内膜容受性紧密相关的重要的生命活动过程。高玲等［8］研究发现，子宫内膜异位症患者子宫内膜中miR-155表达高于正常子宫内膜，且miR-155的表达能够调控子宫内膜间质细胞增殖与凋亡。明琪［9］研究表明，miR-155在正常子宫内膜的分泌中期低表达，参与胚胎植入和内膜的蜕膜化过程。金属基质蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）是一种能够降解细胞外基质的蛋白质水解酶。MMP在多种生物过程中都发挥重要作用，包括细胞的增殖和分化、子宫内膜的容受性、肿瘤的血管生成等［10-12］。本研究主要探讨miR-155及其靶基因MMP16在RIF患者子宫内膜的表达情况。

1 对象和方法

1.1 研究对象 选取2018年5月至2019年12月在秦皇岛市妇幼保健院生殖医学科进行体外受精与胚胎移植（in vitro fertilization and embryo transfer，IVF-ET）或者卵细胞质内单精子注射（intracytoplasmic sperm microinjection，ICSI）治疗的不孕患者，其中由于男方因素或者输卵管因素于我科首次进行IVF-ET或ICSI助孕后妊娠并分娩的患者15例作为对照组，年龄23～37岁；至少进行3次移植（新鲜或者解冻的胚胎，每次至少有一枚优质胚胎，移植优质胚胎数≥4）均未妊娠的患者15例作为RIF组，年龄23～37岁。所有研究对象均采用常规的长方案进行控制性超促排卵。纳入标准：①符合不孕症的诊断标准［13］；②年龄23～37岁；③进行3次及以上取卵周期，且每个周期有一个优质胚胎移植而未孕；④基础内分泌正常，且有正常月经周期；⑤进入周期前6个月未进行过宫腔操作或使用激素类药物。排除标准：①宫腔异常形态；②染色体异常或其他遗传因素引起的反复植入失败；③既往有影响卵巢反应性的疾病，如早发性卵巢功能不全、卵巢早衰、多囊卵巢综合征；④子宫内膜异位症患者；⑤可移植的优质胚胎（7细胞以上，碎片＜10%的卵裂胚，或者4BB、5BB的囊胚）≤3个；⑥有传染性疾病；⑦输卵管积水。本研究经秦皇岛市妇幼保健院伦理委员会讨论通过（批准文号为：秦伦字20180523号），所有研究对象均签署知情同意书。

1.2 主要试剂和仪器 Genesy40/50紫外分光光度计（美国赛默飞世尔公司）；7500实时荧光定量PCR（qRT-PCR）仪（美国应用生物系统公司）。

人子宫内膜癌细胞株（HEC-1A）购自上海中科院细胞库；DMEM培养基和胎牛血清购自美国HyClone公司；胰蛋白酶购自美国GiBCO公司。miR-155模拟物（miR-155 mimics）、miR-155抑制物（miR-155 inhibitor）、无关序列（模拟物对照，抑制物对照）以及相关引物均购于沈阳万类生物公司；高纯miRNA提取试剂盒购于瑞士Roche公司；Lipofectamine2000购于沈阳万类生物科技公司；荧光定量PCR试剂盒购于ThermoFisher公司；pmir-GLOVector质粒购于上海捷瑞生物工程公司；双荧光素酶报告基因试剂盒以及MMP16抗体（ab73877）、β-actin抗体和辣根过氧化物酶标记的二抗均购自Abcam（上海）公司。

1.3 内膜标本的采集 所有研究对象均在进入治疗周期前一个月经周期的第21～22天（LH峰的第7天或排卵后第6天）体内行宫腔镜取内膜或者子宫内膜刺激时留取。将内膜一式2份，一份送病理科用于切片和免疫组化的检查，一份保存于液氮中用于mRNA和蛋白质印迹的检测，并收集取内膜日的空腹静脉血2 mL，离心后留取上清液，保存于-20℃待用。

1.4 细胞培养与转染 将人子宫内膜癌细胞株（HEC-1A）接种于含有10%胎牛血清的DMEM培养基中，于37℃、5%CO2的培养箱中培养，待细胞生长到80%融合时，加入胰蛋白酶消化，传代，取对数生长期的细胞采用Lipofectamine2000试剂盒进行转染（严格按照试剂盒操作规程完成），转染24 h后收集细胞进行各项检测。在转染miR-155的实验中，分为miR-155模拟物组、miR-155抑制物组以及各自对照组。

1.5 qRT-PCR检测miR-155以及MMP16 mRNA的表达 采用高纯miRNA提取试剂盒提取总RNA，参照反转录试剂盒得到cDNA，然后以cDNA为模板进行qRT-PCR扩增反应。严格按照SYBR Green qPCR试剂盒进行操作，反应体系：SYBR Premix ExTaqII（2×）10μL，cDNA 2μL，4μmol/L上、下游引物各0.5μL，dH2O补足体系至20μL；反应条件为：95℃5 min，循环1次；95℃15 s，60℃30 s，72℃30 s，共循环40次。miR-155以U6为内参，采用2△△Ct法计算miR-155的相对表达量。根据NCBI中MMP16和miR-155的序列号（Gene ID：4325和Gene ID：406947），利用Primer primer 5.0软件进行引物设计，均由上海生工生物公司合成，引物序列见表1。

表1 各基因的引物序列及扩增长度

1.6 双荧光素酶报告基因系统验证miR-155对MMP16的调控作用 通过生物信息学手段，根据Targetscan、DB、starbase、tarbase来预测miR-155的潜在靶点，分析结果发现MMP16 mRNA的3′UTR区为miR-155的潜在靶点。将含有miR-155结合位点在内的MMP16 3′UTR区进行PCR扩增，然后将扩增片段插入到pmirGLO载体中，载体命名为pmirGLO-MMP16-wide type（MMP16-3′UTR-WT）；设计针对MMP16 3′UTR“种子区”的突变引物，插入到pmirGLO载体多克隆位点中，载体命名为pmirGLO-MMP16-mutant（MMP16 3′UTR-Mut）。所有关于载体和报告基因的转染均由沈阳万类生物公司完成。MMP16 3′UTR-WT、MMP16 3′UTR-Mut分别与miR-155模拟物、miR-155抑制物以及各自的对照（mimics control、inhibitor control）两两组合共转染到HEC-1A细胞中。转染后48 h，收集HEC-1A细胞进行各组细胞萤火虫萤光素信号及海肾萤光素信号的检测，实验重复3次。

1.7 Western blot检测MMP16蛋白表达水平 采用RIPA裂解缓冲液（Beyotime）按照标准操作从组织和细胞中提取总蛋白质。采用BSA法测定蛋白浓度，根据吸光度（A595nm）值从标准曲线中计算蛋白质的浓度。根据蛋白质浓度计算上样量。本研究实验的样品量为20μL，上样量为30μg。临用前加入样品缓冲液：2%十二烷基硫酸钠、100 mmol/L二硫苏糖醇、60 mmol/L Tris（pH 6.8）、0.01%溴酚蓝和10%甘油。在电极（正极）上依次叠放PVDF膜和凝胶。转膜结束后，将膜浸入封闭液（含5%脱脂奶粉的TBS）中缓慢振荡后洗涤；加入兔抗人MMP16抗体（批号ab73877），4℃缓慢振荡过夜；加HRP标记的二抗（1∶10 000稀释），室温缓慢振荡2 h后洗涤；以β-action作为内参，采用Quantity One软件将条带转化为灰度值，蛋白质表达量=目的条带灰度值/内参条带灰度值。

1.8 统计学分析 采用SPSS20.0软件进行统计学分析。正态分布的计量资料以±s表示，两组间比较采用单因素方差分析（One-way ANOVA），相关分析采用Pearson相关；以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 一般资料的比较 比较RIF组和对照组的年龄、不孕年限、BMI、不孕因素、不孕类型、受精方式，差异均无统计学意义（P均＞0.05）。见表2。

表2 RIF组和对照组一般资料的比较（±s）

表2 RIF组和对照组一般资料的比较（±s）

指标 RIF组（n=15）对照组（n=15） F（χ2）值 P值年龄（岁） 33.45±1.24 32.76±1.95 1.156 0.257不孕年限（年） 3.82±0.69 4.23±0.75 1.558 0.130 BMI（kg/m2） 23.13±2.47 23.78±1.96 0.798 0.431不孕类型［n（%）］ 原发 7（46.67） 6（40.00） 继发 8（53.33） 9（60.00） 0.136 0.713不孕因素［n（%）］ 男方因素 4（26.67） 5（33.33） 输卵管因素 7（46.67） 6（40.00） 男方+输卵管因素 4（26.66） 4（26.67） 0.188 0.910受精方式［n（%）］ IVF 9（60.00） 7（46.67） ICSI 6（40.00） 8（53.33） 0.536 0.464

2.2 RIF组和对照组控制性促排卵及移植日内膜厚度的情况 比较RIF组和对照组HCG日的E2、P以及获卵数、Gn用量、Gn天数、移植日内膜厚度，差异均无统计学意义（P均＞0.05）。见表3。

表3 两组患者控制性促排卵情况的比较（±s）

表3 两组患者控制性促排卵情况的比较（±s）

分组 HCG日E2（pmol/L）HCG日P（nmol/L）获卵数（个） Gn用量（IU） Gn天数（d）移植日内膜厚度（mm）RIF组（n=15） 10 798.54±453.79 2.53±0.98 12.45±2.01 2 109.84±389.05 12.45±1.08 11.12±1.90对照组（n=15） 10 953.74±892.53 2.41±1.05 11.78±1.96 1 980.37±562.86 13.67±2.14 11.85±2.13 t值 0.600 0.324 0.924 0.733 1.971 0.991 P值 0.553 0.749 0.363 0.470 0.058 0.330

2.3 RIF患者内膜组织miR-155的表达水平 RIF组子宫内膜miR-155的表达水平（1.28±0.08）高于对照组（0.33±0.03），差异有统计学意义（P＜0.05）。

2.4 MiR-155调控MMP16的表达 双荧光素酶报告实验显示，miR-155模拟物和MMP16 3′UTR-WT共转染HEC-1A细胞后，细胞的荧光信号与对照组比较明显受到抑制；miR-155抑制物和MMP16 3′UTR-WT共转染HEC-1A细胞后，细胞的荧光信号与对照组比较，明显增强。miR-155模拟物或者miR-155抑制物共转染MMP16 3′UTR-Mut后，荧光信号与对照组比较没有明显变化（P＞0.05），见图1。进一步的实验结果表明，转染miR-155模拟物能够下调MMP16的mRNA和蛋白质的表达水平；转染miR-155抑制物能够上调MMP16的mRNA和蛋白的表达水平，结果与对照组比较，差异有统计学意义（P＜0.05）。见图2。

图1 MiR-155对HEC-1A细胞的MMP16基因表达的靶向抑制

图2 转染miR-155对HEC-1A细胞中MMP16基因和蛋白质表达的影响

2.5 RIF组和对照组子宫内膜MMP16 mRNA和蛋白质的表达情况 RIF组MMP16 mRNA的表达水平（2.11±0.15）低于对照组（3.02±0.06），差异有统计学意义（P＜0.05）；进一步的Western blot实验结果显示，RIF组MMP16蛋白的表达水平（0.43±0.07）低于对照组（0.97±0.03），差异有统计学意义（P＜0.05）。见图3。

图3 RIF组和对照组子宫内膜MMP16的表达情况

2.6 RIF患者子宫内膜中miR-155和MMP16相关性分析 经过Pearson相关性分析，RIF患者子宫内膜miR-155和MMP16蛋白的表达水平呈负相关（r=-0.976，P＜0.05）。

3 讨论

胚胎成功植入是生殖医学领域的研究热点。子宫内膜在胚胎植入时有一个短暂的容受性良好的窗口期，此时期在各种激素的协调控制下，内膜经历一系列的周期性改变。一般在排卵后6～8 h，子宫内膜最适应胚胎的植入［14］，否则容易引起植入失败。因此，准确判断窗口期及种植窗口期子宫内膜调控的分子机制就变得越来越重要。miRNA的异常表达对反复流产、胚胎着床、胚胎早期发育、子宫内膜容受性等方面均有影响。纪娜等［15］研究表明，miR-155的表达及其靶基因Bax、Bcl-2、MMP2和MMP9的表达量对子宫内膜细胞的生长有着显著的影响。Drissennek等研究了RIF患者移植窗口期子宫内膜miRNA的差异表达谱，结果发现miR-155和miR-152与植入失败相关，并经过验证［16］。Chen等［17］证实整合素连接激酶低表达通过失活Wnt/β-catenin信号传导并降低MMP-3/9表达而降低了子宫内膜的容受性。

本研究通过生物信息学、双荧光素酶实验和转染实验证实miR-155通过与MMP16 3′UTR结合，从而抑制MMP16 mRNA的表达。RIF组MMP16 mRNA的表达水平低于对照组（P＜0.05），RIF患者的MMP16与miR-155的表达水平呈负相关（P＜0.05）。MMP16是一种金属基质蛋白，在细胞的增殖、分泌及内膜的容受性等方面均发挥重要作用，miR-155对子宫内膜容受性的调节作用可能是通过下调MMP16的表达而发挥作用。在临床工作中，我们可以通过miR-155和MMP16在内膜上的表达情况预测反复种植失败的情况，从而节省胚胎、减轻患者心理负担。本课题主要研究miR-155在RIF患者内膜的表达，在分子机制的层面研究子宫内膜容受性的调控，以寻求改善容受性的策略，提高辅助生殖技术（ART）的成功率和胚胎利用率。而IVF-ET或者ICSI周期的患者除进行控制性促排卵外，移植后需要进行黄体支持，我们的研究结果只能表明RIF患者的基础状态下的内膜miR-155和MMP16表达情况与反复植入失败的关系。尽管与控制性促排卵周期相比，自然周期中的子宫内膜发育可能涉及不同的基因表达模式，但子宫内膜生物标志物的测定可能有助于预测较低的受孕机会，为患者咨询、子宫内膜准备和冻融胚胎移植提供基础。

本研究初步发现miR-155与RIF相关，而miR-155调控RIF的可能机制是通过调节MMP16基因表达实现。下一步的研究需要更深入地采用功能性的实验来确定miR-155如何调控子宫内膜的容受性。由于我们的样本量不足，研究可能存在一定的偏倚。但是仍然希望这项研究能够对辅助助孕周期中发生RIF的风险做出预测，并为临床治疗提供更为科学的指导。