长链非编码RNA CTC-459F4.3异常表达对肝癌上皮-间质转化的影响*

王 波 金 雯 杨 梅 王跃华

(1铜陵职业技术学院医学护理系；2铜陵市人民医院肿瘤科 安徽铜陵 244061)

上皮-间质转化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)是上皮细胞向间质细胞转化的生物学行为，在此过程中，恶性肿瘤细胞可突破基底膜、入侵血液及淋巴循环从而完成侵袭、转移的目的，而远处转移是影响肝细胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)预后的关键因素之一。长链非编码RNA(long chain non-coding RNA，Lnc RNA)并不具备编码蛋白质的能力，一度被认为“毫无价值”。但越来越多的研究表明[1-3]，Lnc RNA在HCC的发生、发展中具有重要的作用，如参与细胞周期调节、调控上下游信号转导、影响肿瘤耐药、促进肿瘤微血管生成等。Lnc RNA家族庞大，CTC-459F4.3是新近发现的成员，相关报道较为鲜见。因此基于微环境针对CTC-459F4.3开展HCC早期事件的研究有助于丰富人类对Lnc RNA的进一步认知。该研究旨在观察CTC-459F4.3表达下调对HCC侵袭、迁移的影响，探讨CTC-459F4.3在HCC中对上皮-间质转化的作用，以期为HCC早期诊治的临床决策提供新思路。

1材料与方法

1.1材料来源

SMMC-7721细胞培养于ATCC细胞库。

1.2主要试剂与仪器

CTC-459F4.3 shRNA慢病毒质粒(上海吉凯)；DMEM(Gibco，C11995500CP)；RPMI 1640(Gibco，C11875500BT)；胎牛血清(Bio IND，04-002-1A)；Antibiotic-Antimycotic(Lifetechnologies，15240-112)；PBS，pH7.4(Gibco，10010-023)；Trypsin-EDTA(0.05%)(Lifetechnologies，25300-054)；牛血清白蛋白(Lifetechnologies，15561012)； 细胞培养皿：Coning，430167；细胞培养板：Costar，3524；75cm2细胞培养瓶：Corning，43063；Transwell小室 ：Corning，3422 (8μm孔径)；酶标仪：BioTek，EPOCH等。

1.3方法

1.3.1细胞培养与转染 10%胎牛血清的培养基培养于37℃CO2培养箱中，5%CO2，相对湿度90%。用0.125%胰蛋白酶37℃条件下作用3～5 min。培养基轻洗1次，去除死亡细胞的碎片及残余胰酶。加入DMEM / RPMI 1640完全培养基5mL，反复吹打，制成细胞悬液，接种于25mL培养瓶中，1:2分瓶培养。于对数期接种于6孔板中，一定滴度的慢病毒滴入每孔转染细胞，48h后收集细胞。分别设CTC-459F4.3敲低组、对照组、空质粒组，采用RT-PCR方法检测转染效率。

1.3.2RT-PCR检测CTC-459F4.3转染效率 细胞悬液加入600μL Buffer RL，反复吹打使其充分裂解、mRNA完全分离；离心后，收集RNA溶液，采用分光光度计定量，估算提取总量10ug，超低温保存。按照cDNA合成说明书配置反应体系；依据定量PCR试剂盒说明进行扩增实验。50℃，2min；95℃，10min；40循环；95℃，15S，60℃，60S。收集数据，采用2-ΔΔCt法计算RT-PCR结果相对表达量。

表1 引物序列表

1.3.3 Western-Blot检测 配制12%分离胶和4%浓缩胶；SDS-PAGE 电泳1.5h，电流为浓缩胶25mA，分离胶30mA 。转膜400mA转移0.5h、1% BSA对膜进行封闭40min；一抗4℃孵育过夜；二抗孵育37℃孵育1h；PBS清洗3次后，按照试剂盒说明书配制ECL显色工作液、荧光拍照，凝胶图像系统分析光密度值。

1.3.4Transwell侵袭、迁移试验 接种前将24孔板和Transwell小室用1×PBS浸泡5min湿润；用胰蛋白酶消化细胞后，1% FBS的培养基重悬细胞，调整密度1×105细胞/mL，接种到Transwell小室内，每个小室分别加0.2mL各组细胞悬液，下层加入0.8mL含10% FBS的完全培养液，置于37℃培养箱中培养12h；培养12h后，每孔加入1mL4%多聚甲醛溶液，室温固定15min；吸去固定液，用1×PBS洗涤2次，每孔加入1mL 0.5%结晶紫溶液，染色60min后用1×PBS洗3次，晾干；用棉签小心擦去Transwell小室上部内没有迁移的细胞，置于显微镜下观察。

1.4统计学方法

采用SPSS 22.0统计软件分析实验结果，计量资料采用均数±标准差表示，组间采用方差分析，以p<0.05为差异有统计学意义。

2结果

2.1CTC-459F4.3 shRNA转染效率

CTC-459F4.3敲低组、对照组、空质粒组CTC-459F 4.3 mRNA表达量分别为：0.376±0.0399；0.746±0.492；0.752±0.269；组间比较发现，CTC-459F4.3敲低组与对照组和空质粒组比较均有统计学意义(F=88.368，p<0.001)；两组差异无统计学意义(p=0.867)。详见图1。

图1 CTC-459F4.3 shRNA慢病毒质粒转染效率

2.2Western-Blot检测结果

CTC-459F4.3敲低组、对照组、空质粒组E-cadherin表达量分别为：1.040±0.070；1.334±0.293；1.320±0.162；组间比较发现，CTC-459F4.3敲低组与对照组和空质粒组比较均有统计学意义(F=40.994，p<0.001)；对照组与空质粒组比较差异无统计学意义(p=0.728)。CTC-459F4.3敲低组、对照组、空质粒组N-cadherin表达量分别为：1.515±0.162；1.387±0.033；1.393±0.176；组间比较发现，CTC-459F4.3敲低组与对照组和空质粒组比较均有统计学意义(F=28.138，p=0.001)；对照组与空质粒组比较差异无统计学意义(p=0.778)。详见图1。

图2 三组Western-Blot检测结果

2.3Transwell侵袭检测结果

CTC-459F4.3敲低组、对照组、空质粒组穿透下室细胞数分别为：137.667±5.686个；51±2.0个；47±2.0个。组间比较发现，CTC-459F4.3敲低组与对照组和空质粒组比较均有统计学意义(F=585.653，p<0.001)；对照组与空质粒组比较差异无统计学意义(p=0.230)。见图3。

图3 三组Transwell侵袭检测结果

2.4Transwell迁移检测结果

CTC-459F4.3敲低组、对照组、空质粒组迁移细胞数分别为：132.67±2.082个；43.33±2.517个；45.33±2.082个。组间比较发现，CTC-459F4.3敲低组与对照组和空质粒组比较均有统计学意义(F=1561.156，p<0.001)；对照组与空质粒组比较差异无统计学意义(p=0.315)。详见图4。

图4 三组Transwell迁移检测结果

3讨论

HCC作为常见的消化系统恶性肿瘤之一，其诊断和治疗一直以来备受学者们的瞩目。早期切除虽是最有效的手段之一，但总体生存率仍不理想。Lnc RNA家族被发现在表观遗传学、转录水平及转录后蛋白修饰介导某些信号基因的表达，以致恶性肿瘤细胞产生相应的生物学行为。EMT是细胞的上皮属性减弱或缺失并部分或全部获得间质特性的现象，此过程可使细胞粘附能力减弱而伴随运动能力的增强。因此，EMT被认为是恶性肿瘤包括HCC转移、扩散的关键环节，众多研究发现Lnc RNA可以发挥癌基因作用参与EMT的进程。

随着高通量检测技术的进步，学者们已经发现了至少3万余个Lnc RNA在各类疾病中表达失调[4]。部分Lnc RNA被发现起到促进EMT的作用，lncRNA-n335586在HCC中高表达可通过调控miR-924/CKMT1A信号轴来实现正向促进肝癌细胞迁移，侵袭和EMT及体内转移[5]。lncRNA-HOTAIR是学者们研究较多的Lnc RNA之一，HOTAIR高表达，可通过介导miR-23b-3p-Zeb-1通路增强EMT，促进HCC细胞的侵袭、迁移，而Zeb信号基因可以与E-cadherin编码的CDH1启动子E2位点结合实现对EMT的影响[6]。HOTAIR可以调控信号蛋白如：阿片类生长因子受体(opioid growth factor receptor，OGFr)的表达，敲低HOTAIR可调节OGFr过表达从而抑制了HCC细胞的转移[7]。此外，还有不少Lnc RNA对EMT进程有正向效应[8-10]。Lnc RNA家族中也有不少对EMT起抑制作用，lncRNA-CASC2可以通过miR-367-FBXW7信号轴的调控， 逆转上皮表型向间质表型转化，其机制与lncRNA-CASC2高表达上调FBXW7有关。CADM1-AS1低表达与HCC晚期分期、早期转移和低生存率相关，其过表达可抑制HCC增殖、侵袭和转移，并通过对PTEN/AKT/GSK-3β信号通路及细胞周期的调控诱导HCC细胞停滞于G0/G1期，发挥其抑癌基因作用[12]。CTC-459F4.3是新近报道的lncRNA，张军等研究显示，CTC-459F4.3基因过表达能够抑制HCC的增殖和迁移[13]，而针对该基因的研究，目前尚不多见。

E-cadherin表达下调，N-cadherin上调是EMT的特征之一。Western-Blot检测发现，与对照组和空质粒组比较，CTC-459F4.3基因敲除组E-cadherin表达下调，N-cadherin上调，差异有统计学意义(p<0.05)，提示CTC-459F4.3基因敲除后可以促进EMT。Transwell侵袭试验结果显示CTC-459F4.3基因敲除组肝癌细胞侵袭数量多于对照组和空质粒组差异有统计学意义(p<0.05)；Transwell迁移试验结果显示CTC-459F4.3基因敲除组肝癌细胞迁移数量多于对照组和空质粒组差异有统计学意义(p<0.05)。上述结果提示CTC-459F4.3基因敲除后能够增强HCC的侵袭和迁移能力，促进EMT进程。

综上，该研究发现，CTC-459F4.3可通过调控E-cadherin和N-cadherin的表达，发挥其抑癌基因的作用，CTC-459F4.3敲除后可以促进HCC的EMT进程。须要指出的是，有关Lnc RNA CTC-459F4.3的研究并不多见，其参与HCC侵袭、迁移的机制尚不清楚。课题组将深入探究CTC-459F4.3与HCC发展分子机制的关系，为完善Lnc RNA基因诊断提供理论依据。