卵巢癌组织中CXCR3表达与免疫细胞浸润的相关性研究

高境泽，吴霞

[上海交通大学医学院附属仁济医院(上海市妇科肿瘤重点实验室) 妇产科，上海 200127]

最近几年肿瘤免疫治疗取得了突破性进展，尤其是PD-1/PD-L1通路阻断治疗已在多种恶性肿瘤中获得了显著疗效[1]。然而，迄今尚无单一指标能够完全准确预测PD-1/PD-L1阻断治疗的疗效。因此，探寻其他生物标志物，将其与PD-L1表达或肿瘤免疫分型特征相结合，有望更精准地筛选出PD-1/PD-L1阻断治疗的潜在获益者。随着对免疫治疗作用机制的深入探索，越来越多的研究发现基于肿瘤抗原产生、提呈、识别、免疫效应细胞浸润及杀伤等多步骤的肿瘤免疫微环境特征可能是识别患者是否对免疫治疗产生应答的重要因素。

在肿瘤微环境中，免疫细胞的迁移及激活与趋化因子家族密切相关。趋化因子受体CXCR3，也称G蛋白偶联受体9或CD183，是与CXCL9、CXCL10、CXCL11结合发挥免疫调节功能的蛋白受体，由IFN-γ触发在激活的T细胞、CTL、NK细胞表面大量表达。CXCR3与其配体CXCL9、CXCL10在募集CD8+T细胞到肿瘤病灶过程中发挥至关重要的作用[2-3]。在B16黑色素瘤小鼠模型中，与野生型小鼠相比，CXCR3-/-小鼠的肿瘤生长速度更快且个体存活率更低[4]；此外，PD-1单抗不能抑制该基因敲除小鼠的肿瘤生长[4]。另一项研究发现，CXCR3趋化因子系统可通过增强肿瘤微环境中CD8+T细胞的活化和增殖提高抗PD-1单抗的抗肿瘤效应[5]。基于以上研究及CXCR3对CD8+T细胞募集的关键作用，本研究拟探索CXCR3表达与免疫微环境特征的相关性以及其表达是否可作为免疫治疗的潜在生物标志物。

卵巢癌(ovarian cancer， OC)是恶性程度最高的常见女性生殖器官肿瘤之一，尽管OC患者可从肿瘤细胞减灭术及一线化疗中获益，但75%以上的晚期患者仍然会出现复发并最终死亡，因此迫切需要探索传统治疗手段以外的治疗策略[6]。近年来，研究者围绕PD-1/PD-L1阻断治疗于OC患者的作用展开初步探索，如KEYNOTE-028、KEYNOTE-100等多个临床试验。然而，已有的结果表明，抗PD-1单抗治疗OC的客观缓解率仅为8%～15%。因此，亟待探索相关的生物标志物以帮助筛选潜在获益患者[7-8]。为深入分析CXCR3在OC肿瘤微环境及抗肿瘤免疫应答通路中发挥的生物学作用，本研究利用癌症基因组图谱(The Cancer Genome Atlas, TCGA)数据库中OC样本数据，首先分析了CXCR3表达对患者总生存时间(overall survival，OS)的影响，进而通过京都基因与基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)及基因集富集分析(Gene Set Enrichment Analysis，GSEA)揭示了CXCR3与相关通路基因表达的相关性；同时，使用单样本基因集富集分析(Single Sample Gene Set Enrichment Analysis，ssGSEA)探索CXCR3在OC肿瘤微环境中与各免疫细胞组分的相关性。

1 资料与方法

1.1 数据库来源本研究中OC患者基因表达和临床资料数据分析采用加利福尼亚大学圣克鲁兹分校系统处理的TCGA数据库(https：//xenabrowser.net/data %20 pages/)。按关键词“Ovarian Cancer”和工作流程“HTSeq-FPKM-UQ”筛选样本后，共下载得379例浆液性OC样本的基因表达信息和相应临床数据。

1.2 OC患者的生存分析以总样本CXCR3表达量的中位数为阈值将TCGA中的OC样本分为CXCR3high与CXCR3low两组，并使用Kaplan-Meier法分析CXCR3表达对数据库中OC患者OS的影响(患者OS为初次记录的诊断时间至最后一次回访时间) 。

1.3CXCR3high组和CXCR3low组间的差异表达基因分析为评估CXCR3的生物学功能，通过DEGseq[9]方法计算得到了两组间差异表达的基因，并根据q值(校正P值)<0.05和倍数变化(fold change，FC)的绝对值>2.0得到差异表达基因。

1.4 差异表达基因的生物学功能注释在获得差异表达基因之后，应用clusterProfiler[10]这一高质量的R包中的KEGG数据库资源(http：//www.kegg.jp/)，使用映射的方法对CXCR3显著相关高表达的差异表达基因进行注释。KEGG是一个生物信息学常用数据库，由基因、蛋白质(基因组信息)和化学物质(化学信息)三大模块组成。KEGG数据库针对这些模块间的相互作用将模块的生物学功能和关系集成形成代表生物体功能的分子网络。本研究中，如果KEGG项的P值<0.001且错误发生率(false discovery rate, FDR)<5%，该条KEGG功能被定义为显著富集。除KEGG富集外，本研究还使用GSEA进行全局富集分析。GSEA是一种计算方法，用于鉴定一组基因是否在两个生物学状态之间显示出统计学上显著且一致的差异，该软件下载自Broad Institute门户网站[11]。本研究以全基因表达矩阵为输入基因集，以CXCR3的表达水平为输入组标记进行基因集分析。

1.5 肿瘤浸润免疫细胞亚群的定量为比较CXCR3high和CXCR3low组之间肿瘤浸润免疫细胞定量的差异，使用“GSVA”R包进行ssGSEA，分析RNA序列数据[12]。ssGSEA通过其绝对表达量对基因进行排序，计算其经验累积分布差异，最后计算样本中的富集分数。根据ssGSEA的结果分析CXCR3与各免疫细胞标志物表达是否存在相关性并计算相关性系数r值。

1.6 统计学处理通过R 3.1.3版软件(https:∥www.r-project.org/)进行统计学分析，应用R语言cor.test()函数计算免疫细胞亚群与CXCR3表达的Pearson相关性系数并进行可视化，定量资料采用t检验分析，检验水准(α)为0.05。

2 结果

2.1 肿瘤组织CXCR3表达与OC患者OS的关系根据CXCR3表达量的中位数将TCGA中OC患者分为CXCR3high组与CXCR3low组，并进一步通过Kaplan-Meier法分析其表达与OC患者OS的关系。结果发现，CXCR3表达水平与患者预后关系密切，CXCR3high组患者的OS较CXCR3low组显著延长[P=0.017，风险比(hazard ratio,HR)=0.74，95%CI：0.57～0.96, 图1]。

图1 TCGA数据库中OC患者CXCR3表达与OS的关系

2.2 筛选差异表达基因及其生物学功能注释本研究以log2(FC)的绝对值>2.0和q值(校正P值)<0.05为筛选标准，共得到246个差异表达基因，包括40个下调基因和206个上调基因。将表达上调的基因映射到KEGG数据库，进行CXCR3潜在生物学功能相关通路的筛选。结果显示，OC样本中的CXCR3高表达相关的差异表达基因主要富集于趋化因子通路，细胞黏附分子、PD-1/PD-L1检查点相关通路，Th1与Th2分化通路及Th17分化通路。接着，通过TCGA数据库以CXCR3为标签，通过GSEA中的c2.cp.all.v.7.0数据库进行富集分析，发现CXCR3的表达与IFN-γ信号通路[NOMP=0.000，标准化富集分数(normalized enrichment score, NES)=2.183，总体错误率(family-wise error rate, FWER)P=0.001]及IL-6-JAK-STAT3信号通路(NOMP=0.000，NES=2.140，FWERP=0.001)显著相关。(图2)

2.3 肿瘤微环境中免疫细胞各组分的表达量与CXCR3表达的关系根据ssGSEA算法，得到TCGA数据库OC患者各免疫细胞组分的表达量，将CXCR3的表达量作为标签，发现随着其表达量的增加，各免疫细胞组分的表达也随之升高(图3)。

图3 CXCR3与肿瘤微环境中各类免疫细胞组分表达量的关系

2.4CXCR3表达与多类免疫细胞组分表达量的相关性为明确CXCR3表达与各免疫细胞组分的关系，对两者进行相关性分析。研究发现CXCR3与CTL等24种免疫细胞组分的表达均呈显著正相关(均P<0.05， 图4)。随后，研究使用Pearson相关性分析计算CXCR3表达与免疫细胞组分表达的相关系数r值，并基于r>0.4、该免疫细胞可能在抗PD-1单抗治疗中发挥重要作用这两个因素筛选得6种免疫细胞：T细胞、CTL、DC、巨噬细胞、Th1和CD8+T细胞。分析结果显示，CXCR3与T细胞、CTL、DC、巨噬细胞、Th1和CD8+T细胞表达呈显著正相关(均P<0.001，r值分别为0.84、0.75、0.64、0.64、0.74和0.48， 图5)。

图4 CXCR3表达与肿瘤微环境中各类免疫细胞组分表达量的相关性

注：TPM为每百万条reads的转录本(transcripts per million)。图5 CXCR3表达与肿瘤微环境中各类免疫细胞组分表达量的相关性

3 讨论

既往研究表明，CXCR3高表达于包括胃癌、肝癌在内的多种恶性肿瘤，与患者的OS延长相关。Chen等[13]对169 份胃癌组织及其91份配对癌旁组织进行免疫组化分析发现，与癌旁组织相比，CXCR3在胃癌组织中高表达。该研究同时证明，在胃癌组织中CXCR3的表达与肿瘤侵袭深度、TNM分期和淋巴结转移数呈反比，与肿瘤组织浸润DC、CD8+T细胞数和更长的OS呈正比，综合推测CXCR3的高表达或在胃癌中起促进抗肿瘤免疫应答及抑制肿瘤进展的作用[13]。在TCGA数据库中同样发现，胃癌组织[14]和肝癌组织[15]中较高的CXCR3表达均与更好的预后显著相关，而这种相关性目前认为与CXCR3诱导肿瘤微环境中CD4+和CD8+T细胞数量增加密切相关[16]。本研究通过对TCGA数据库中427例OC样本进行生存分析发现，CXCR3表达水平与OC患者良好预后同样存在显著相关性，可能原因是CXCR3高表达组病灶中存在较多的肿瘤浸润淋巴细胞，后者发挥肿瘤杀伤功能并最终延长患者的生存期。

晚期OC肿瘤微环境中CD8+T细胞、CD4+T细胞和B细胞等多种肿瘤浸润淋巴细胞数增加与较好的预后显著相关[17]，CXCR3趋化因子轴对这部分肿瘤浸润淋巴细胞归巢、增殖起至关重要的作用。近年来有研究还发现CXCR3诱导多种类型肿瘤(如乳腺癌、结肠癌、黑色素瘤)免疫微环境中CD8+T细胞的迁移与活化[18-21]，且CXCR3+T细胞数与抗PD-1抗体疗效密切相关，肿瘤微环境中较多的CXCR3+CD8+T细胞及CXCR3+CD4+T细胞浸润数与更好的抗PD-1抗体阻断治疗疗效相关。Chow等[5]发现CXCR3表达缺陷的荷瘤小鼠对抗PD-1抗体治疗反应较差，反之CXCR3高表达小鼠抗PD-1抗体疗效较好，CXCR3介导的CD8+T细胞抗肿瘤免疫反应增强是其内在原因。此外，Routy等[22]研究发现，小鼠口服嗜黏蛋白阿克曼菌后肿瘤组织浸润的CXCR3+CCR9+CD4+T细胞数量增加，且肿瘤微环境中累积的CXCR3+CCR9+CD4+T细胞恢复了抗PD-1单抗对小鼠肿瘤的疗效。Spranger等[21]探究了在抗PD-1抗体治疗后CXCR3表达引起的肿瘤微环境变化，他们发现在黑色素瘤患者中肿瘤微环境CD103+DC产生的CXCL9诱导CXCR3+CD8+T细胞迁移至肿瘤病灶，随后该细胞产生的IFN-γ重新诱导免疫细胞表达CXCL9和CXCL10，进一步招募CXCR3+CD8+T细胞迁移至肿瘤病灶。因此，当肿瘤微环境存在较多数量的CXCR3+T细胞时，抗PD-1抗体治疗不仅能逆转微环境中免疫细胞的耗竭，同时激活CXCR3趋化因子通路从而募集更多的T细胞归巢发挥肿瘤杀伤功能，并因此得到更好的治疗效果。

本研究中，根据CXCR3表达量对TCGA数据库中的OC样本转录组数据进行样本分组和基因差异表达分析，并在后续对CXCR3相关的高差异表达基因进行KEGG富集分析。结果发现，CXCR3高表达相关差异表达基因主要富集于趋化因子通路、细胞黏附分子通路、PD-1/PD-L1免疫检查点通路、Th1与Th2分化通路及Th17分化通路。在肿瘤微环境中，IL-12诱导T细胞分化为Th1，活化后的Th1优势表达CXCR3，并与CXCL9、CXCL10及CXCL11结合，在免疫应答中发挥作用。免疫衰竭型肿瘤微环境形成的一个理论是Th1型细胞趋化因子(CXCL9、CXCL10及CXCL11)的有效沉默。Tan等[23]研究发现，当使用表观遗传重编程药物脱氧胞苷改善Th1型趋化因子表达时，PD-L1抑制剂的治疗效果得到改善。此外，CXCR3表达与多种抗肿瘤免疫细胞组分表达呈正相关，这提示在OC免疫微环境中，CXCR3高表达的肿瘤组织或存在富集的DC、Th1、CD8+T细胞及更活跃的PD-1/PD-L1通路信号(图3～图5)。CXCR3轴在既往研究中同样也与特定类型的OC分子分型及较强的CD8信号相关。2011年，TCGA研究组将CXCR3轴视为筛选OC肿瘤微环境免疫活跃型肿瘤的重要标志物，该研究根据高级别浆液性OC肿瘤组织中mRNA表达特征将OC分为如下4种分子分型：增生型、间质型、免疫反应型和分化型，其中，免疫反应亚型OC的特征是关键标志基因CXCR3、CXCL10和CXCL11的表达[24]。2018年，Thorsson等[25]使用生物信息学方法对TCGA泛癌症图谱中33种肿瘤进行了免疫基因分析，作者根据OC免疫特征将肿瘤划分为6种亚型：伤口愈合型、IFN-γ型、炎症型、淋巴细胞缺乏型、免疫沉默型和TGF-β型，其中OC是以IFN-γ为最主要免疫功能特征的免疫原性肿瘤。CXCR3及其3个配体皆由IFN-γ诱导表达，且IFN-γ免疫亚型特征为具有强烈的CD8信号和较高的Th1增殖水平，这与本研究结果基本一致，再次证明了IFN-γ下游驱动CXCR3轴所发挥的生物学功能在OC中或占据重要地位[25]。

综上所述，本研究表明，OC肿瘤组织中CXCR3高表达可能通过增强淋巴细胞募集信号通路从而富集肿瘤微环境中浸润的免疫细胞，并提高PD-1/PD-L1通路活性和促进Th1分化。CXCR3的表达对于评估肿瘤微环境中是否具有较活跃的抗肿瘤免疫应答意义重大。将来CXCR3或可作为预测OC患者响应PD-1/PD-L1阻断治疗的生物标志物之一，将CXCR3与PD-L1表达或肿瘤突变负荷联合有望更精准地筛选出潜在获益患者。本研究为探索CXCR3作为OC PD-1/PD-L1阻断治疗生物标志物的潜在价值提供了初步信息。