miR-30e-5p通过靶向ATG5基因调控肝癌细胞增殖、凋亡及自噬

李泓町，高丽萍

(1. 重庆市中医院 肝病科，重庆 400021；2.重庆市中医院 肿瘤科，重庆 400021)

肝癌是发生于肝脏的恶性肿瘤，包括原发性肝癌和转移性肝癌2种，较常见的是原发性肝癌。接受手术治疗的肝癌患者通常具有高复发率，这可能是导致患者五年总体生存率较低的原因之一[1]。因此，需要充分了解肝癌发生和进展的分子机制，以找到新的靶点来改善肝癌的临床治疗效果。研究发现，miRNA在肝癌发生和进展中发挥重要的生物学作用[2-3]，这为肝癌的治疗提供了新的见解。一些研究发现，miR-30e-5p在许多人类肿瘤中表达下调，包括结直肠癌、非小细胞肺癌和乳腺癌等[4-6]。一项研究对与原发性肝癌早期诊断相关的miRNA进行了筛选，发现miR-30e-5p在肝癌中呈低表达[7]。然而，miR-30e-5p在人类肝癌中的生物学作用及机制尚不明确。研究发现，在肝癌组织中自噬相关基因5(autophagy-related gene 5，ATG5)的表达水平明显升高，与肝癌的发病及进展密切相关[8-9]。本研究前期通过生物信息学软件预测发现，miR-30e-5p与ATG5基因3＇非翻译区(untranslated region，UTR)存在靶向结合位点，提示miR-30e-5p可能通过调控ATG5基因的表达影响细胞生物学行为。因此，本研究探讨miR-30e-5p对肝癌细胞增殖、凋亡和自噬的影响及其可能的分子机制，以期为肝癌的诊断和治疗提供新的靶点。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂人正常肝细胞HL-7702及人肝癌细胞MHCC97H、Huh7、HCCLM3购于中国科学院上海细胞库；FBS、脂质体Lipofectamine 2000转染试剂盒购于Invitrogen公司；DMEM培养液购于Hyclone公司；青霉素-链霉素双抗购于北京雷根生物技术有限公司；MTT购于Sigma公司；miR-30e-5p mimics及对照mimics-NC购于上海吉玛制药技术有限公司；RNA提取试剂盒、SYBR Premix Ex Taq检测试剂盒购于武汉优博生物技术有限公司；反转录试剂盒、双荧光素酶报告基因检测试剂盒购于Promega公司；含野生型ATG5基因3＇UTR序列和突变型ATG5基因3＇UTR序列的pCHECK2-ATG5-3＇UTR-Wt(ATG5-Wt)以及pCHECK2-ATG5-3＇UTR-Mut(ATG5-Mut)的荧光素酶报告基因表达载体构建由生工生物工程(上海)有限公司完成；试验所用引物由华大基因科技有限公司合成；Annexin Ⅴ-FITC细胞凋亡检测试剂盒购于BD公司；除抗体外的Western blotting检测所需试剂均购于碧云天生物技术研究所；ATG5、微管相关蛋白轻链3(microtubule-associated protein light chain 3， LC3)、Ras相关结合蛋白7(Ras-associated binding protein 7, RAB7)、p62抗体及二抗均购于CST公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 将人正常肝细胞HL-7702及人肝癌细胞MHCC97H、Huh7、HCCLM3常规复苏后，培养在含10%FBS及1%青霉素-链霉素混合液的DMEM培养液中，放置于37 ℃、5%CO2恒温培养箱中培养，及时观察细胞生长状态，2 d更换1次新鲜培养液，2～3 d传代1次，取处于对数生长期的细胞用于后续试验。

1.2.2 细胞分组和转染 将处于对数生长期的人肝癌细胞MHCC97H随机分为3组：对照组、miR-30e-5p转染(miR-30e-5p)组和转染对照(mimics-NC)组。将各组MHCC97H细胞在转染前1 d以2×103个/孔接种到6孔板中，放置于37 ℃培养箱中继续培养，待细胞贴壁生长、汇合度达50%左右时，参照Lipofectamine 2000转染试剂盒说明书中的步骤进行转染，将miR-30e-5p组MHCC97H细胞转染miR-30e-5p mimics，mimics-NC组MHCC97H细胞转染对照mimics-NC，对照组MHCC97H细胞不做转染处理。转染6 h后将各组MHCC97H细胞培养液更换成正常培养液，于37 ℃培养箱中继续培养，转染48 h后分别收集各组细胞，进行相应指标检测。

1.2.3 qRT-PCR 采用RNA提取试剂盒提取处于对数生长期的HL-7702、MHCC97H、Huh7、HCCLM3细胞及转染48 h后各组MHCC97H细胞的总RNA，使用微量紫外分光光度计测定总RNA的纯度和丰度。取适量RNA反转录合成第1链cDNA。使用SYBR Premix Ex Taq检测试剂盒进行qRT-PCR。反应条件：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 20 s，进行40个循环。以U6为内参，检测细胞中miR-30e-5p的相对表达量；以GAPDH为内参，检测细胞中ATG5 mRNA的相对表达量。计算方法采用相对定量2-△△Ct法。(表1)

表1 qRT-PCR引物

1.2.4 MTT试验 用胰蛋白酶消化处于对数生长期的MHCC97H细胞，将其以5×103个/孔接种至96孔板中，按照上述“1.2.2”中方法进行分组和转染，每组设置3个复孔。48 h后向各孔细胞中加入5 mg/mL的MTT溶液20 μL，于37 ℃培养箱中常规培养4 h。取出细胞，弃去上清液，再向细胞中加入150 μL二甲基亚砜，于摇床上低速振荡10 min。使用全自动酶标仪测定光密度[D(450 nm)]值，试验重复3次。

1.2.5 克隆形成试验 用含10%FBS的DMEM培养液重悬处于对数生长期的MHCC97H细胞，将其以1×103个/孔接种至6孔板中，分组和转染处理MHCC97H细胞，每组设置3个复孔。将各组MHCC97H细胞于37 ℃、5%CO2培养箱中继续培养，待各组出现明显克隆球时终止培养。使用95%乙醇固定细胞，以4 g/L结晶紫对细胞进行染色，随后计数并拍照。试验重复3次。

1.2.6 FACS 用胰蛋白酶消化各组转染48 h的MHCC97H细胞，收集细胞，向细胞中加入适量的结合缓冲液重悬细胞，制成密度为1×106个/mL的单细胞悬液。取100 μL细胞悬液，分别向细胞悬液中加入Annexin Ⅴ-FITC和碘化丙啶(propidium iodide, PI)染液各5 μL，混匀，于室温下避光孵育15 min，随即用流式细胞仪检测各组MHCC97H细胞的凋亡情况。试验重复3次。

1.2.7 Western blotting 将处于对数生长期的人肝癌细胞MHCC97H接种至6孔板中，接种密度为1×104个/mL，每孔接种1 mL，分组和转染48 h后使用细胞刮刀刮下细胞，离心，加入细胞裂解液于冰上裂解30 min，离心后小心吸取上清液即总蛋白。用二喹啉甲酸(bicinchoninic acid，BCA)蛋白浓度测定试剂盒对总蛋白进行定量检测，待蛋白变性后取等量蛋白样品上样，行SDS-PAGE，待蛋白分离后采用湿转法进行转膜。将膜浸入含5%脱脂奶粉的封闭液中于室温下封阻1.5 h，用TBST洗膜后加入相应一抗(LC3、RAB7、p62和ATG5的稀释比例分别为1∶1 000、1∶1 000、1∶1 000、1∶500)，4 ℃过夜孵育，次日以TBST洗膜，再加入稀释比例为1∶3 000的二抗，于室温下孵育1～2 h。TBST洗膜后，以ECL试剂显色，在凝胶成像系统中曝光、拍照，以GAPDH为内参，使用Quantity one软件分析各条带灰度值，计算各组MHCC97H细胞中目的蛋白的相对表达水平。试验重复3次。

1.2.8 双荧光素酶报告基因试验 TargetScan等生物信息学软件预测结果显示，miR-30e-5p与ATG5 3＇UTR存在特异性靶向结合位点，表明ATG5可能是miR-30e-5p的一个靶基因。将构建好的ATG5-Wt和ATG5-Mut荧光素酶报告基因表达载体与miR-30e-5p mimic或mimics-NC共转染至MHCC97H细胞，转染48 h后使用双荧光素酶检测系统分别检测萤火虫荧光素酶活性和海肾荧光素酶活性，计算各组细胞中相对荧光素酶活性。相对荧光素酶活性=萤火虫荧光素酶活性/海肾荧光素酶活性。试验重复3次。

2 结果

2.1 miR-30e-5p在人肝癌细胞中的表达qRT-PCR结果显示，人正常肝细胞HL-7702及人肝癌细胞MHCC97H、Huh7、HCCLM3中miR-30e-5p的表达水平分别为1.00±0.11、0.13±0.01、0.32±0.03、0.44±0.05，与人正常肝细胞HL-7702相比，人肝癌细胞MHCC97H、Huh7、HCCLM3中miR-30e-5p的表达水平均明显降低(P<0.05)。人肝癌细胞MHCC97H中miR-30e-5p的表达水平最低，因此选取MHCC97H细胞用于后续试验。

2.2 过表达miR-30e-5p对MHCC97H细胞增殖能力的影响qRT-PCR结果显示，与mimics-NC组相比，miR-30e-5p组MHCC97H细胞中miR-30e-5p的表达水平明显上调(P<0.05)，对照组miR-30e-5p的表达水平无明显变化(P>0.05)。MTT试验结果显示，与mimics-NC组相比，miR-30e-5p组MHCC97H细胞D值明显下调(P<0.05)，对照组D值无明显变化(P>0.05)。克隆形成试验结果显示，与mimics-NC组相比，miR-30e-5p组细胞克隆形成数明显减少(P<0.05)，对照组细胞克隆形成数无明显变化(P>0.05， 图1)。(表2)

图1 各组MHCC97H细胞克隆形成能力的检测

表2 各组MHCC97H细胞中miR-30e-5p 表达水平、D值及细胞克隆形成数的比较

2.3 过表达miR-30e-5p对MHCC97H细胞凋亡的影响FACS结果显示，对照组、mimics-NC组和miR-30e-5p组MHCC97H细胞凋亡率分别为(4.51±1.04)%、(5.14±1.22)%和(21.75±3.65)%，与mimics-NC组相比，miR-30e-5p组MHCC97H细胞凋亡率明显升高(P<0.05)，对照组MHCC97H细胞凋亡率无明显变化(P>0.05)。(图2)

图2 各组MHCC97H细胞凋亡率的检测

2.4 过表达miR-30e-5p对MHCC97H细胞自噬的影响Western blotting结果显示，与mimics-NC组相比，miR-30e-5p组MHCC97H细胞中自噬相关标志蛋白LC3Ⅱ、RAB7、p62的表达下调(P<0.05)，LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值明显降低(P<0.05)，对照组中LC3Ⅱ、RAB7、p62的表达水平及LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值无明显变化(P>0.05)。(图3、表3)

图3 Western blotting检测各组MHCC97H细胞中自噬相关标志蛋白的表达

表3 各组MHCC97H细胞中LC3Ⅱ、LC3Ⅰ、RAB7、p62表达水平的比较

2.5 miR-30e-5p对ATG5靶向调控关系的验证TargetScan等生物信息学软件预测结果显示，miR-30e-5p与ATG5基因3＇UTR之间存在互补配对碱基。双荧光素酶报告基因试验结果显示，miR-30e-5p能够显著抑制ATG5-Wt的相对荧光素酶活性(P<0.05)，而对ATG5-Mut的相对荧光素酶活性无明显影响(P>0.05)。qRT-PCR和Western blotting结果显示，与mimics-NC组相比，miR-30e-5p组MHCC97H细胞中ATG5 mRNA和蛋白表达明显下调(P<0.05)，对照组中ATG5 mRNA和蛋白表达水平无明显变化(P>0.05)。(图4)

注：A.miR-30e-5p与ATG5基因3＇UTR的靶向结合位点；B.双荧光素酶报告基因试验检测miR-30e-5p与ATG5的靶向关系；C.qRT-PCR和Western blotting检测ATG5 mRNA和蛋白表达。与mimics-NC组比较，*P<0.05。图4 miR-30e-5p靶向ATG5关系的验证

3 讨论

肝细胞癌属于原发性肝癌，占肝癌的85%以上，是世界范围内常见的肿瘤。在中国，肝细胞癌的发病率占所有恶性肿瘤病例的50%以上，严重影响人们的健康[10]。在肝细胞癌发病及进展中，miRNA已被充分研究并显示出其致癌或抑癌功能[11]。miRNA是一类小的内源性非编码RNA，其通过与靶基因的3＇UTR结合而与几个关键的肿瘤生物过程相关联，包括肿瘤细胞增殖、分化、凋亡和自噬等[12]。先前的研究已经证明，miR-30e-5p是一种新型肿瘤抑制因子，在人类多种类型的恶性肿瘤中发挥重要作用[4，13]。一项研究表明，在原发性肿瘤中高水平表达的miR-30e-5p与乳腺癌的良好预后相关[14]。另一项研究显示，miR-30e在肝细胞癌患者血清中的表达水平显著低于健康志愿者，表明血清miR-30e是一种新的肝细胞癌非侵袭性生物标志物[15]。研究发现，HBV感染可通过靶向MAP4K4信号通路的miR-30e-5p抑制活化T细胞核因子5的表达， 从而促进肝癌发生[16]。后续研究证实了miR-30e-5p在肝癌患者血清中呈低表达[17]。因此，本研究在以往研究的基础上采用qRT-PCR检测人正常肝细胞和不同株人肝癌细胞中miR-30e-5p的表达水平，结果显示miR-30e-5p在肝癌细胞中的表达水平明显低于正常肝细胞。这提示miR-30e-5p在肝癌的发生和发展中可能作为抑癌基因发挥作用。

为探究miR-30e-5p对肝癌细胞增殖、凋亡和自噬的影响，本研究选择miR-30e-5p基础表达水平最低的人肝癌细胞MHCC97H为研究对象，通过转染miR-30e-5p mimics过表达miR-30e-5p，且通过qRT-PCR验证了转染效果。进一步的MTT和克隆形成试验结果显示，过表达miR-30e-5p可明显抑制MHCC97H细胞的增殖和克隆形成。此外，FACS结果显示，过表达miR-30e-5p能够促进MHCC97H细胞凋亡。这与Feng等[18]在肝癌细胞中、Egan等[19]在前列腺癌中的研究相一致。LC3是研究最广泛的自噬标志蛋白，包括LC3 Ⅱ和LC3Ⅰ 2种蛋白，LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值的大小可在一定程度上反映细胞自噬水平的高低[20]。RAB7参与细胞自噬小体的形成及成熟过程，其含量可决定自噬通量，参与自噬的重要环节[21]。p62是自噬流下游的标志蛋白，参与自噬小体-溶酶体蛋白的降解过程[22]。本研究Western blotting检测结果显示，过表达miR-30e-5p后MHCC97H细胞中LC3、RAB7和p62蛋白表达水平有不同程度的下调，这表明miR-30e-5p可抑制MHCC97H细胞自噬的发生。众所周知，miRNA通常通过调控靶基因的表达实现对细胞生物学行为的影响。ATG5基因参与自噬体的形成，在自噬过程中起关键作用[23]。研究发现，ATG5基因在肝癌组织中呈高表达，提示肝癌的恶性进展可能与ATG5基因介导的自噬密切相关[24]。前期通过生物信息学手段预测发现，ATG5基因可能是miR-30e-5p的一个直接靶基因。因此，本研究采用双荧光素酶报告基因试验和Western blotting进行验证，结果显示miR-30e-5p能够靶向负调控ATG5基因的表达。

综上所述，过表达miR-30e-5p能够显著抑制人肝癌细胞MHCC97H的增殖和自噬，并促进细胞凋亡，其作用机制可能与miR-30e-5p靶向调控ATG5基因表达有关。本研究只是初步研究miR-30e-5p对肝癌细胞的影响及机制，其具体分子机制仍不十分明确，并且本研究只采用单一细胞株进行试验，尚显不足，后续试验将对此进行深入探究。