狼疮肾炎患者不典型抗中性粒细胞胞质抗体检测的临床意义

陈惠娟，詹富国，高丽钦，荀振，梁晓华，欧启水

(1.福建医科大学附属第一医院 检验科，福州 350005；2.福建医科大学第一临床医学院，福州 350005)

系统性红斑狼疮(systemic lupus erythematosus, SLE)是临床常见的自身免疫病，它是一种免疫反应介导的，以免疫性炎症为主要表现的弥漫性结缔组织病[1]。在疾病的发展过程中，很多患者会出现肾脏受累，导致狼疮肾炎(lupus nephritis，LN)，而肾功能衰竭是SLE患者死亡的主要原因之一。抗中性粒细胞胞质抗体(antineutrophil cytoplasmic antibody，ANCA)是以中性粒细胞和单核细胞胞质成分为靶抗原的自身抗体。1982年，Davies等[2]报道在节段性坏死性肾小球肾炎患者血清中发现了ANCA， 以后陆续在多种疾病(肉芽肿性多血管炎、系统性血管炎和原发性坏死性新月体性肾小球肾炎)患者中检测到ANCA[3-4]。ANCA可以活化补体，通过该途径引起炎症反应，导致小血管壁炎症和纤维素样坏死，损伤肾脏和其他脏器[5]。而也有不少研究报道SLE患者体内也存在ANCA，且ANCA阳性的SLE患者发生LN的可能性更大[6]。目前实验室的ANCA检测方法主要为ELISA和间接免疫荧光法(indirect immunofluorescence assay，IIF)[7]。IIF-ANCA检测根据乙醇和甲醛固定的人中性粒细胞中ANCA颗粒呈现的荧光染色形态的不同，可分为阴性、核周型(peripheral ANCA，pANCA)、胞质型(cytoplasmic ANCA，cANCA)和不典型(atypical ANCA，aANCA)。一般认为，pANCA的靶抗原主要是髓过氧化物酶(myeloperoxidase，MPO)；cANCA的靶抗原主要是蛋白酶3(proteinase 3，PR3)；aANCA的靶抗原目前尚未确认。国内外有不少关于LN患者血清ANCA的研究，但主要针对pANCA和cANCA[8-9]，对aANCA的报道较少。本研究旨在探究LN患者血清aANCA与实验室检测指标的关系，帮助业内提高对此类患者的认识，以期为临床工作提供参考。

1 资料与方法

1.1 研究对象收集整理2010年1月至2018年12月于福建医科大学附属第一医院肾内科住院治疗的aANCA阳性LN患者(25例)临床及实验室资料。LN患者的纳入标准符合1997年美国风湿病学会修订的SLE诊断标准，并经肾活检确诊为LN；排除药物性SLE和药物导致的ANCA假阳性病例。同时，收集同期ANCA阴性的LN患者(61例)临床及实验室资料作为对照。在LN治疗过程中，部分患者发生ANCA荧光模型转换，如血清aANCA阳性转换为ANCA阴性，或者由ANCA阴性转换为aANCA阳性。收集分析aANCA发生血清转换的LN患者的实验室资料，进行深入比较分析。收集的实验室检测指标包括ANCA、抗核抗体(antinuclear antibody, ANA)(ELISA法)、抗dsDNA抗体、抗核抗体谱[欧蒙印迹法，包括抗核糖核蛋白(nuclear ribonucleoprotein， nRNP)/Smith(简称Sm)、抗Sm、抗SS-A、抗SS-B、抗Ro-52、抗Scl-70、抗Jo-1、抗CENPB、抗组蛋白、抗核小体、抗核糖体P蛋白抗体]，补体C3、C4，血常规、总蛋白、血清白蛋白、肌酐、尿素、尿酸、胱抑素C、尿常规等。研究过程中患者或其家属获得充分告知并签署知情同意书，研究获得福建医科大学附属第一医院伦理委员会批准。

1.2 试剂与仪器6种自身抗体检测试剂盒[包括抗MPO IgG抗体(ELISA法)、抗PR3 IgG抗体(ELISA法)、抗dsDNA IgG抗体(ELISA法)、抗核抗体谱IgG(ELISA法)、抗核抗体谱IgG(欧蒙印迹法)、抗中性粒细胞胞质/抗肾小球基底膜IgG抗体(IIF)]，均购自欧蒙医学诊断(中国)有限公司；全自动ELISA分析仪，来自TECAN公司；EUROStar Ⅲ Plus荧光光学显微镜、EURO Blot Master Ⅱ型全自动免疫印迹仪，来自欧蒙医学诊断(中国)有限公司；IMMAGE 800特定蛋白分析仪，来自美国贝克曼库尔特有限公司；Modular P800生化分析仪，来自罗氏诊断产品(上海)有限公司；ADVIA 2120i血液分析仪，来自西门子(中国)有限公司；AUTION MAX AX-4280全自动尿液分析仪，来自爱科来国际贸易(上海)有限公司；UF-1000i全自动尿液分析仪，来自希森美康医用电子(上海)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 样本的采集 采集患者空腹静脉血，进行自身抗体及实验室指标的检测。同时收集患者清晨尿液进行尿常规检测。

1.3.2 血清抗体的检测 按照试剂盒说明书检测血清ANCA水平，于荧光显微镜下观察ANCA的荧光模型。其余自身抗体根据说明书分别在全自动ELISA分析仪和全自动免疫印迹仪上检测。

1.3.3 外周血样本实验室指标的检测 补体C3、C4水平于IMMAGE 800特定蛋白分析仪上检测；血清生化指标于Modular P800生化分析仪上检测；血常规分析于ADVIA 2120i血液分析仪上检测。

1.3.4 尿液样本的检测 于AUTION MAX AX-4280全自动尿液分析仪上检测尿液，得到尿隐血、尿蛋白结果；于UF-1000i全自动尿液分析仪上检测尿沉渣结果。

2 结果

2.1 两组患者的一般资料比较患者的一般情况如下(表1)，其中15例LN患者发生aANCA转换，9例由aANCA阳性转换为ANCA阴性，6例由ANCA阴性转换为aANCA阳性；其中男性2例，女性13例。

表1 LN患者的一般情况

2.2 两组患者自身抗体水平检测结果的比较两组患者抗MPO抗体和抗PR3抗体均呈阴性(表2)。aANCA阳性组抗dsDNA抗体水平[(465.7±267.3) IU/mL]较ANCA阴性组[(252.9±258.0) IU/mL]显著升高(P=0.001)，同时aANCA阳性组抗核小体抗体阳性率(59.09%)也显著高于ANCA阴性组(26.23%)(P=0.010)，而其余抗体水平在两组间差异无统计学意义(均P>0.05)(表2)。就aANCA发生转换的LN患者而言，aANCA阳性和ANCA阴性患者的抗MPO抗体和抗PR3抗体也均呈阴性(表3)。aANCA阳性组抗dsDNA抗体水平、抗组蛋白抗体和抗核小体抗体阳性率较ANCA阴性组显著升高[(465.7±287.7) IU/mLvs(246.8±230.2) IU/mL、60.00%vs20.00%、46.67%vs6.67%，P值分别为0.029、0.025和0.013]，而其余自身抗体阳性率的差异无统计学意义(均P>0.05)(表3)。

表2 aANCA阳性和ANCA阴性组患者血清自身抗体水平的比较

表3 aANCA发生转换的患者血清自身抗体水平比较

2.3 两组患者的血常规结果比较两组患者在白细胞计数、血小板计数、血红蛋白浓度、中性粒细胞计数、淋巴细胞计数、中性粒细胞/淋巴细胞比值、血小板/淋巴细胞比值、血小板体积分布宽度上差异无统计学意义(均P>0.05，表4)。就aANCA发生转换的LN患者而言，两组患者的血常规结果差异无统计学意义(均P>0.05，表5)。

表4 aANCA阳性和ANCA阴性组患者血常规比较

表5 aANCA发生转换的患者血常规结果比较

2.4 两组患者的血清生化及免疫学指标检测结果比较aANCA阳性和ANCA阴性组患者在总蛋白、白蛋白、尿素、尿酸、肌酐、胱抑素C、估算肾小球滤过率 [estimated glomerular filtration rate, eGFR; (采用)慢性肾脏病流行病学合作研究组公式(the Chronic Kidney Disease Epidemiology Collaboration equation, CKD-EPI公式)]等指标上差异无统计学意义(均P>0.05，表6)。aANCA阳性组补体C3、C4水平显著低于ANCA阴性组[(0.45±0.22) g/Lvs(0.58±0.25) g/L、(0.08±0.05) g/Lvs(0.12±0.07) g/L，P值分别为0.022、0.022，表6]。就aANCA发生转换的LN患者而言，两组患者的上述生化及免疫指标差异均无统计学意义(均P>0.05，表7)。

表6 aANCA阳性和ANCA阴性组患者血清生化及免疫学指标比较

表7 aANCA发生转换的患者血清生化及免疫学指标比较

2.5 两组患者的尿常规检测结果比较与ANCA阴性组相比，aANCA阳性组患者的尿隐血发生率显著升高(96.00%vs75.41%，P=0.026，表8)；而尿红细胞含量、白细胞含量、尿蛋白、尿液管型等指标差异无统计学意义(P>0.05， 表8)。就aANCA发生转换的LN患者而言，两组患者的上述尿常规检测结果差异无统计学意义(P>0.05，表9)。

表8 aANCA阳性和ANCA阴性组患者尿常规检测结果比较

表9 aANCA发生转换的患者尿常规检测结果比较

3 讨论

SLE病因及发病机制复杂，可累及全身多个系统、器官，患者出现蝶形红斑、发热、尿血等症状。于SLE患者体内可检测到包括ANCA在内的多种自身抗体。IIF和ELISA是ANCA推荐的检测方法。

对aANCA的认识晚于pANCA和cANCA。有报道在急性疟疾[10]、慢性炎症性肠病和自身免疫性肝病[11-12]及各种结缔组织病[13](SLE、类风湿关节炎等)患者血清中检测到aANCA。Yahya等[10]发现急性疟疾患者中49.50%呈aANCA阳性，这部分患者中抗蛋白酶G抗体阳性的占93.00%，抗MPO抗体阳性的占2.00%，而抗PR3、人白细胞弹性蛋白酶、乳铁蛋白酶等抗体检出率均为0。Terjung等[11]也发现在慢性炎症性肠病和自身免疫性肝病患者血清中aANCA呈阳性。上海瑞金医院肾内科曾报道aANCA阳性的结缔组织病患者以肝脏、肾间质病变较为突出[13]。本研究中，aANCA阳性的LN患者的抗MPO抗体、抗PR3抗体均为阴性，这与此研究中aANCA阳性的LN患者检测结果一致。ANCA可引起中性粒细胞脱颗粒，产生具有致病作用的氧自由基，同时释放出的中性粒细胞颗粒中的各种蛋白酶具有引起炎症、组织破坏等作用。

本研究发现，aANCA阳性组的LN患者体内抗dsDNA抗体滴度较ANCA阴性组更高(P=0.001)。抗dsDNA抗体与疾病活动度有关，这预示着aANCA阳性组的LN患者疾病活动度较ANCA阴性组更高。患者体内持续存在的dsDNA-抗dsDNA抗体复合物沉积于肾小球、关节或血管基底膜，导致肾小球肾炎、关节炎等器官损害。循环免疫复合物是引起组织损伤的触发因素，而非引起组织损伤的直接原因。LN患者体内的循环免疫复合物可以通过补体的经典激活途径激活补体，在这过程中消耗补体C3、C4，使得血清中的C3、C4水平降低。本研究中aANCA阳性组的LN患者体内C3、C4含量均显著低于ANCA阴性组(P值分别为0.022、0.022)，这与徐兆珍等[14]的报道一致。就aANCA发生转换的LN患者而言，aANCA阳性组C3、C4较ANCA阴性组降低，但差异无统计学意义(P>0.05)，推测原因可能是样本较少，今后可扩大样本量加以观察比较。本研究还发现aANCA阳性患者的抗核小体抗体阳性率显著高于ANCA阴性组(P=0.010)，这与郑朝晖等[15]的报道一致。研究发现，抗核小体抗体参与了LN增生性病变的发生发展，可能与核小体-抗核小体抗体形成的抗原抗体复合物在肾小球基底膜沉积有关。他们还发现，抗核小体抗体阳性可能预示着不良预后，因此aANCA阳性合并抗核小体抗体阳性的患者应得到足够的重视[15]。ANCA是小血管炎的生物标志物，ANCA相关性血管炎(ANCA-associated vasculitis， AAV)具有非免疫复合物性小血管炎的病理特征。研究认为SLE患者ANCA阳性支持SLE与AAV重叠综合征的学说[16]。因此，临床上ANCA阳性的LN患者或许需要更积极有效的免疫抑制治疗。

本研究未发现aANCA阳性组与ANCA阴性组的血常规有明显差异，这与王渊等[17]的报道一致。SLE患者发生LN时，肾功能已明显受损。本研究显示aANCA阳性患者发生尿隐血的百分比更高，但其尿红细胞计数、白细胞计数、尿蛋白、尿液管型与ANCA阴性患者相比并无显著升高(P>0.05)。两者血清中的尿素、肌酐、胱抑素C、eGFR-EPI等也没有显著差异(P>0.05)。这与MPO-ANCA阳性的LN病例相关报道不一致[17]。这可能是因为aANCA阳性LN患者的靶抗原为MPO以外的某种或某些物质，其致病机制或许与MPO阳性组不同。

目前对aANCA阳性LN患者的靶抗原尚未有统一的认识。本研究中所有aANCA阳性患者的抗MPO抗体、抗PR3抗体均为阴性，以后需要对aANCA靶抗原做更多的探究。aANCA是否参与肾病致病过程抑或仅是机体免疫调节紊乱所产生的多克隆自身抗体之一仍有待深入探讨。

综上所述，aANCA阳性LN患者体内某些自身抗体水平异常升高，炎症水平升高，提示aANCA可能参与LN的疾病发生发展。