离心血液异常分离在多发性骨髓瘤患者Ig检测中的意义

2021-06-08 02:07张靖宇朱金英张静范洪
现代免疫学 2021年3期
关键词:分型红细胞密度

张靖宇,朱金英,张静,范洪

(河北省沧州中西医结合医院 实验诊断科,沧州 061001)

多发性骨髓瘤(multiple myeloma,MM)属浆细胞恶性肿瘤,其特点是骨髓中浆细胞克隆性增殖并分泌大量无效的Ig。患者以高钙血症、肾功能受损、高感染风险、贫血和骨破坏等为主要临床表现。除上述常见临床表现,MM患者存在血液异常分离现象, 其仅在离心后方可观察到,其中报道较多的是分离胶漂移现象[1-2],根本原因是异常增加的Ig导致血清密度增加,当其密度高于分离胶密度时即出现此现象。此外,也有报道MM患者由于血液黏度增加导致分离胶和红细胞层不能有效分离,出现红细胞和分离胶杂糅的现象[3]。该实验室在日常工作中发现部分MM患者外周血离心后出现了分层异常同时伴分离胶漂移的特殊现象,其间在检测Ig时发现相应免疫分型的Ig浓度出现假性减低情况,说明Ig检测时存在钩状效应。本研究旨在探讨离心血液异常分离在MM患者Ig检测中的意义,现报道如下。

1 资料与方法

1.1 实验资料

1.1.1 临床资料 收集河北省沧州中西医结合医院2010年1月至2019年10月收治的187例MM病例,所有研究对象临床资料完整。纳入标准:(1)患者须符合2017年修订的《中国多发性骨髓瘤诊治指南》[4]诊断标准;(2)患者或其家属知情同意并签署知情同意书。排除标准:(1)患者采集血液样本前应用过造影剂;(2)通过透析管采集的血液样本。本研究经河北省沧州中西医结合医院医学伦理委员会批准。

1.1.2 试剂与仪器 分离胶采血管、肝素锂抗凝管,购自沧州永康医药用品有限公司;血浆总蛋白、白蛋白、血钙、乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase, LDH)、血清肌酐(serum creatinine, Scr)、Ig试剂盒,购自迈克生物科技股份有限公司;BNⅡ特定蛋白分析仪及配套免疫球蛋白κ型、免疫球蛋白λ型,来自西门子(中国)有限公司;XE-5000全自动血液分析仪及原装配套试剂,来自希森美康医用电子(上海)有限公司;样本前处理系统、7600型全自动生化分析仪,来自日立(中国)有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 样本的采集及处理 采集研究对象空腹静脉血3 mL至分离胶采血管中,静置30 min后经样本前处理系统1 185×g离心10 min,观察外周血样本离心结果。对于分离异常的样本增加离心力(2 600×g)继续离心10 min;对仍存在异常分离结果的患者采集肝素锂抗凝血离心后取血浆检测相关指标;对超过Ig平衡点浓度的样本进行稀释后重测。

1.2.2 观察指标 收集所有MM患者性别、年龄、血浆总蛋白、白蛋白、Ig、血钙、LDH、Scr、血红蛋白(hemoglobin,Hb)、血小板以及疾病免疫分型等临床及实验室资料,并根据外周血离心结果将患者分为异常组和正常组,比较两组患者上述临床指标的差异。

1.2.3 不同浓度梯度IgG和IgA检测样本的制备 抽取高IgG和IgA浓度检测样本各1份, 稀释10倍后重复检测3次取平均值,IgG浓度约为70 g/L, IgA浓度约为60 g/L。用生理盐水倍比稀释高IgG及IgA浓度样本,将IgG配制成2.5、5.0、10.0、15.0、20.0、25.0、30.0、35.0、40.0、45.0、50.0、60.0、70.0(单位:g/L)共13个浓度梯度;IgA配制成1.0、3.0、5.0、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0、15.0、20.0、30.0、45.0、60.0(单位:g/L)共计17个浓度梯度。

1.2.4 IgG和IgA的剂量-反应曲线 采用日立7600型全自动生化分析仪重复检测上述样本3次,计算Ig浓度和光密度D(570 nm)值(IgG)、D(340 nm)值(IgA)的平均值,绘制Ig浓度和光密度的剂量-反应曲线并确定平衡点浓度。

1.3 统计学处理采用SPSS 22.0软件进行统计学处理,组间定性资料比较采用χ2检验, 检验水准(α)为0.05。

2 结果

2.1 MM患者外周血离心后分离结果187例MM患者外周血样本离心后出现2种结果:异常组离心后分4层,自上而下依次为血清、红细胞、分离胶、红细胞,上层血清量极少,其下红细胞层细胞数量明显增多,最下层为少量红细胞,分离胶位于两个红细胞层之间(图1A);正常组分3层,自上而下依次为血清、分离胶和红细胞,血清量较多,分离胶位于血清和红细胞层之间(图1B)。

注:A.异常组;B.正常组。图1 两组MM患者外周血离心后分离结果

2.2 两组患者的临床及实验室指标比较187例MM患者中,异常组51例,其中男性31例,女性20例;对照组136例,包括男性79例,女性57例。结果显示,两组患者在年龄、性别、血钙、LDH、Scr、血小板等指标上差异不显著(均P>0.05),而在总蛋白、白蛋白、Ig、Hb、MM免疫分型等比较中差异显著(均P<0.05)。(表1)

表1 两组患者的临床及实验室指标比较

2.3 两种类型Ig的剂量-反应曲线分析剂量-反应曲线显示,IgG和IgA的平衡点浓度分别约为35.0 g/L和7.0 g/L,达到平衡点后光密度D值随着Ig浓度的增加逐渐降低(图2、图3)。

图2 IgG剂量-反应曲线

图3 IgA剂量-反应曲线

2.4 不同外周血样本离心结果与Ig钩状效应的关系异常组有32例IgG型和19例IgA型MM患者,其中前者的IgG浓度均≥35.0 g/L,后者的IgA浓度均≥7.0 g/L,说明异常组Ig检测时均存在钩状效应。正常组有71例IgG型和38例IgA型MM患者,其中56例IgG型患者IgG浓度≥35.0 g/L,15例IgG浓度<35.0 g/L;35例IgA型IgA浓度≥7.0 g/L,3例IgA浓度<7.0 g/L,说明正常组的Ig检测时部分存在钩状效应。(表2)

表2 不同外周血样本Ig检测结果与其钩状效应的关系

3 讨论

由于能够促进血液快速凝固,又能分离出较多血清,减少离心等待时间,同时可以避免红细胞内容物释放影响检验结果等,分离胶采血管已经被广泛应用于临床实验室检测。分离胶是一种惰性的高分子聚合物,不溶于水,具有耐高热、耐低温、抗氧化、理化性质稳定的特性,部分分离胶还具有抗辐照特性。各采血管厂家使用的分离胶成分略有不同,但大多数以聚烯烃、聚酯、丙烯三者中的一种为主要生产原材料,这些材料虽然在透明度、色泽、黏度、比重等方面有差异,但共同特点是静息状态下均呈网格状结构的凝胶状态,在离心力作用下变为链状结构的流体状态,而离心力撤除后又恢复为凝胶状态。此外,这些材料的密度均介于血清密度(约1.02×103kg/m3)和红细胞密度(约1.08×103kg/m3)之间,因此离心后能够在血清和红细胞之间形成隔离层。有学者[5]通过葡聚糖进行血清密度模拟实验证实了血清密度是影响分离胶位置的主要原因,因此任何导致血清密度增加的因素都可能导致血液离心异常。国外有文献[6]报道透析管采集的血液样本不仅出现分离胶漂移而且出现血清在红细胞层下;也有报道[7]发现应用造影剂的患者出现分离胶漂移,说明透析液和造影剂都可增加血清密度。

本研究结果显示MM患者外周血离心后出现2种分离现象:正常组分3层,自上而下依次为血清、分离胶和红细胞,血清量较多;异常组目测红细胞数量明显增多,血清量极少,自上而下为血清、红细胞、分离胶和红细胞。表1示异常组患者均Hb<85 g/L,说明胶体之上的红细胞层混合了大量血清。由于血清密度小于红细胞密度,当两者不能分离时可以出现混合层密度小于分离胶密度的现象,因此红细胞位于分离胶之上,而最下层红细胞由于血清含量少,密度大于分离胶,所以沉于底部。有报道[8]称该现象可能与高浓度的总蛋白、Ig和低浓度的Hb等因素有关。

本研究通过比较异常组和正常组MM患者的临床及实验室资料发现,两组在年龄、性别、血钙、LDH、Scr、血小板等指标上差异不显著(均P>0.05),而在总蛋白、白蛋白、Ig、Hb、疾病免疫分型上有显著差异(均P<0.05),说明血液离心结果异常的患者可能存在更高浓度的总蛋白、Ig以及较低浓度的白蛋白和较为严重的贫血。Ig的检测常采用免疫透射比浊法,当Ig水平较高时,可能会由于抗原抗体比例不当而导致检测结果偏低甚至出现假阴性的现象, 即钩状效应,这时需稀释Ig才能还原真实结果。钩状效应的识别一直是检验工作中的重点和难点。有学者[9]通过对所有甲胎蛋白浓度>2 000 ng/mL样本的稀释复测,在39 484份样本中发现3例钩状效应引起的抗体浓度假性减低情况,也有报道[10]果糖胺可用于识别IgA的钩状效应,还有报道[11]通过设置仪器参数可识别免疫反应中的钩状效应。本研究的剂量-反应曲线显示,IgG和IgA的平衡点浓度分别为35.0 g/L和7.0 g/L,达到平衡点后光密度D值随着浓度的升高而降低,异常组所有患者Ig含量均高于35.0 g/L,而正常组只有部分患者如此,说明异常组患者Ig检测时均会出现假性减低的情况,也间接说明血液分离异常时Ig检测结果存在钩状效应,而正常血液则不一定存在。

Ig分为5类,即IgG、IgA、IgM、IgD和IgE,其体内含量由高到低也依此排序,其中IgG、IgA、IgM以克为计量单位,而IgD、IgE含量很低, 常规方法很难检测到。《中国多发性骨髓瘤诊治指南》中依照异常产生的Ig类型将MM分为IgG型、IgA型、IgM型、IgD型、IgE型、轻链型、双克隆型以及不分泌型共8种类型,其中IgG型约占(50~70)%,IgA型约占20%,轻链型约占20%,IgD、IgM等类型少见。本研究显示异常组在免疫分型中只有IgG和IgA两种分型,正常组除这两种分型外还有IgD型和轻链型。由于离心血液异常分离提示患者可能存在高浓度的总蛋白、Ig,而体内的IgD、IgE、轻链含量相对较低,即使是单克隆也不足以引起体内Ig异常增高,因此理论上也不会出现离心血液异常分离。由于IgG型、IgA型、轻链型MM占全部MM的绝大部分,而异常分离结果又提示高浓度的Ig,因此当MM患者出现离心血液异常分离时该患者属IgG或IgA型可能性较大,同时也需注意相应免疫分型Ig检测时可能存在钩状效应。虽然理论上IgM型MM可以出现高浓度的总蛋白和Ig,但由于IgM型MM极为罕见,课题组在研究期间也未发现该类型,因此IgM型患者是否会出现血液异常分离现象需进一步研究。

综上所述,MM患者离心后存在血液异常分离现象,而异常分离结果与总蛋白、白蛋白、Ig、Hb、疾病免疫分型有关。另异常血液离心结果提示相应免疫分型Ig检测时可能存在钩状效应,需稀释才能还原真实结果,故应避免假阴性结果误导临床诊治。

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