MeJA诱导OsPR1A的表达水稻对白叶枯病的抗性研究

刘玉晴，兰金苹，燕高伟，王田幸子，朱 峥，李莉云，刘国振，窦世娟

（河北农业大学 生命科学学院, 河北保定 071001）

水稻（Oryza sativaL.）是世界上最重要的粮食作物之一，世界近一半的人口以水稻为主食［1］。但是，水稻生产经常遭受到各种病原菌的侵染，其中由水稻白叶枯病菌（Xanthomonas oryzaepv.oryzae,Xoo）引起的白叶枯病是严重影响水稻产量的细菌性病害之一，可导致水稻的严重减产［2］。在过去的20年中，人们对水稻进行了广泛的遗传和基因组研究，以阐明水稻对Xoo反应的分子机制，已经鉴定了40多种对Xoo具有抗性的抗性基因（Resistant gene, R）［3］，其中的11种已经被克隆，即Xa1，Xa3/Xa26，Xa4，xa5，Xa10，xa13，Xa21，Xa23，xa25，Xa27和xa41［4］。Xa21是第一个被克隆的抗白叶枯病基因，具有广谱的抗性［5］。1995年，宋文源等人发现携带Xa21的水稻转基因植株明显增强了对Xoo的抗性。本实验室吴琼等人对携带有Xa21抗性基因的水稻植株进行接菌，发现随着接菌时间的延长OsPR1A、OsPR1B和OsPR10A 3种蛋白质表达量增多，并且在接菌后144 h与接菌的野生型水稻相比，发现3种蛋白质表达量均高于野生型水稻，表明OsPR1A、OsPR1B和OsPR10A可能参与了Xa21介导的抗病反应途径［6］。近期，本实验室又证明了OsPR1a-RNAi水稻植株降低了Xa21介导的抗白叶枯病的抗性反应（待发表）。OsPR1a在RNA水平上受到稻瘟病菌（Magnaporthe oryzae,M.grisea）和水稻白叶枯病菌侵染后诱导表达，所以OsPR1a经常作为抗病反应发生的标记基因［7-8］。

在水稻抗性反应中，植物激素作为信号分子也发挥着重要的作用。植物激素是调节植物生长发育及应对外界胁迫的重要活性物质。当植物遭受到病原菌侵染后体内会产生一系列植物激素，其中茉莉酸（Jasmonic acid, JA）和水杨酸（Salicylic acid, SA）是与防御相关的主要植物激素［9］，其他植物激素，例如乙烯（Ethylene, ET），脱落酸（Ascisic acid, ABA），生长素（Auxin, IAA），赤霉素（Gibberellins, GAs），细胞分裂素（Cytokinin,CKs）和油菜素类固醇（Brassinosteroids, BRs）也参与防御反应［9］。MeJA，SA，ET，ABA处理水稻离体叶片发现OsPR1a基因受到诱导表达［7,10］。多项研究表明，JA（包括MeJA）是重要的信号分子，在水稻的防御反应中起着重要作用［11-12］。水稻丙二烯氧合酶OsAOS是JA生物合成途径中一个关键的酶，超表达OsAOS的水稻植株中内源JA水平升高，OsPR1a等病程相关蛋白质基因表达量增加，并且增强了对稻瘟病的抗性，表明JA在水稻病程相关基因的诱导和抗稻瘟病中起着重要作用［11］。OsCOI1，作为JA的受体，敲除后降低了水稻对白叶枯病和稻瘟病的抗性［12］。WRKY72减弱了水稻对白叶枯病的抗病性，WRKY72与AOS1的W-Box结合并且在其靶位点诱导DNA超甲基化抑制其转录，引起内源JA水平降低。而SAPK10是ABA诱导的SnPK2型激酶，会磷酸化WRKY72的Thr129位点，从而削弱WRKY72对AOS1转录的抑制［13］。使用Xoo分泌的细胞壁纤维素降解酶、脂酶/酯酶预先处理水稻叶片12 h，随后接菌Xoo可以提高水稻对Xoo的抵抗力，并上调JA生物合成基因和JA响应基因的表达［14］。OsMPK15负调控SA和JA信号介导的水稻对稻瘟病菌和白叶枯病菌的抗性反应。水稻敲除突变体mpk15中病程相关基因组成型表达，SA和JA以及SA和JA合成相关基因表达累积，增强了对稻瘟病和白叶枯病的抗性［15］。MeJA、SA和病原菌可诱导WRKY30基因表达，超表达WRKY30引起JA合成相关基因（LOX和AOS2）、病程相关基因（PR3和PR10/PBZ1）的转录水平升高以及内源JA积累增加，增强了水稻对白叶枯病和稻瘟病的抗性［16］。

由此可见，某些植物激素和抗病基因可通过提高OsPR1A表达来实现抗病的目的。本研究基于抗体的蛋白质组学策略［17］，从蛋白质水平上系统研究植物激素JA、水稻病程相关蛋白OsPR1A和水稻抗白叶枯病之间的关系，通过调控激素、抗病基因和超表达OsPR1A以期达到广谱抗性的目的。

1 材料与方法

1.1 水稻材料

野生型水稻TP309（Oryza sativaL.）以水稻TP309为背景转入Xa21基因的4021；以4021为背景转入OsPR1a-RNAi的转基因植株#351和#352。水稻材料均种植在河北农业大学西校区。

1.2 水稻激素处理

水稻离体叶片激素处理：选取饱满的水稻种子浸泡在30 ℃水中3 d，种子露白后将种子种植到营养土中（营养土与蛭石的比例为1∶1），水稻幼苗培养至4周，将叶片剪其长度为2 cm大小，分别浸泡到浓度为100 μmol/L茉莉酸甲酯（MeJA）、100 μmol/L水杨酸（SA）、100 μmol/L脱落酸（ABA）和1 mmol/L乙烯利（ET）溶液中，在30 ℃ 光照12 h / 黑暗12 h的光周期培养箱中培养。取材时间点为0、2、4和6 d，取材完成后将样品放入装有钢珠的离心管中，然后迅速将样品置于液氮中，-70 ℃超低温冰箱保存备用。

水稻活体幼苗激素处理：水稻萌发后培养5 d，用100 μmol/L MeJA（含0.05% Tween-20）外 源喷施水稻苗至水珠滴下，以不含MeJA的0.05%Tween-20溶液为对照处理水稻幼苗，在30 ℃ 光照12 h / 黑暗12 h的光照培养箱中培养，取材时间点为0、2、4、8、12、18、24、36和48 h，取材 完成后将样品放入装有钢珠的离心管中，然后迅速将样品置于液氮中，-70 ℃超低温冰箱保存备用。

1.3 水稻白叶枯病菌Xoo的培养和接菌处理

选取XooPhilippine Race 6（PR6）菌株在土豆培养基（PDA）上划线培养，温度为28 ℃，培养2～3 d后，用无菌水稀释菌液浓度为OD600=0.5，备用。

水稻幼苗接菌处理：水稻萌发后在27 ℃，光照15 h / 黑暗9 h的光照培养箱中培养2周，用100 μmol/L MeJA（含0.05% Tween-20）喷洒水稻叶片，以不含MeJA的0.05% Tween-20溶液为对照，处理48 h后采用剪叶尖的方法进行接菌Xoo，然后观察表型。

1.4 水稻总蛋白质提取

将保存在-70 ℃超低温冰箱的样品取出，迅速置于液氮中，然后用高速震荡研磨仪研磨样品至粉末状；每0.1 g样品粉末中加入1 mL蛋白质提取缓冲液；涡旋混匀30 s冰上放置2 min，重复5次；4 ℃ 12 000 r/min离心20 min；取上清液，加入上清液体积1/4的5×Loading Buffer；煮沸10 min，总蛋白质样品提取完成，-20 ℃储存备用［18］。

1.5 免疫印迹杂交检测

用10% Tricine胶分离已提取好的水稻总蛋白质样品；电泳条件为80 V，20 min和160 V，90 min；分离完成后将蛋白质转移到PVDF膜上；一抗为anti-OsPR1A多克隆抗体，二抗为HRP标记的羊抗兔二抗；OsHSP82作为校准上样量内参蛋白，一抗为OsHSP82单克隆抗体，二抗为HRP标记的羊抗鼠二抗［19］；WB检测。

2 结果与分析

2.1 不同植物激素处理水稻离体叶片对OsPR1A表达的影响

分别用不含激素的水溶液作为对照处理（CK）和用100 μmol/L MeJA、100 μmol/L SA、100 μmol/L ABA和1 mmol/L ET不同激素处理水稻4021的离体叶片。WB检测发现，如图1-a，对照样品在水稻叶片离体处理后2、4 和6 d时OsPR1A表达增加，说明OsPR1A蛋白质受到机械伤害的诱导表达；在MeJA处理中，OsPR1A同样在第2天开始诱导表达，4和6 d时与对照相比受到强烈的诱导表达。在SA处理的水稻离体叶片中，与对照相比，机械伤害导致的OsPR1A诱导表达在前期被抑制（图1-b）。在ABA处理中，OsPR1A表达受到抑制（图1-c）。在ET处理中，与对照相比，OsPR1A表达丰度呈上升趋势（图1-d）。

图1 水稻离体叶片不同激素处理后在不同时间点OsPR1A的表达情况Fig. 1 Expression of OsPR1A at different time points after treated with different hormones in detached rice leaves

2.2 外源MeJA处理水稻幼苗对OsPR1A表达的影响

在离体水稻4021叶片中发现：OsPR1A在处理后第2 天受到机械伤害和100 μmol/L MeJA的诱导。在此基础上，利用土培5 d的水稻活体幼苗，用100 μmol/L MeJA喷施水稻叶片后，于0、2、4、8、12、18、24、36和48 h时间点取样，以探究在水稻活体组织中喷施MeJA后对OsPR1A表达的影响。经WB检测发现，水稻幼苗地上部在对照和MeJA处理中OsPR1A均不表达（图2-a，2-b）。用水作为对照处理水稻叶片后，在水稻幼苗根部，OsPR1A呈组成型表达（图2-c）；用100 μmol/L MeJA处理水稻叶片后，OsPR1A从处理8 h在根部开始诱导表达并随着时间延长表达量增加（图2-d）。在整个活体水稻植株中，叶片喷施MeJA并没有引起在离体叶片中那样OsPR1A强烈的诱导表达，MeJA信号可能转移到水稻的根部组织，并使根部OsPR1A受到强烈诱导。OsPR1A在根部呈组成型表达，说明OsPR1A可能参与了水稻根系正常生长发育过程。MeJA诱导根部OsPR1A的表达，暗示着MeJA可能参与了调控水稻的抗逆能力。

图2 水稻幼苗中MeJA处理叶片后在不同部位和不同时间点OsPR1A的表达情况Fig. 2 Expression of OsPR1A at different parts and different time points after treated with MeJA in leaves of rice seedings

2.3 外源MeJA处理野生型水稻对Xoo的抗性

为了进一步调查在病原菌存在情况下，MeJA诱导的OsPR1A表达与水稻抗性之间的关系，分别用不含MeJA的水溶液作为对照处理和用100 μmol/L MeJA的溶液喷施处理野生型水稻TP309的叶片，处理48 h后采用剪叶片法接种Xoo，接种菌后0、2、4、6和8 d进行取材，并于接菌后8 d观察病斑大小。结果发现，用100 μmol/L MeJA预处理后再接种Xoo的水稻叶片与对照相比病斑长度缩短，平均缩短约1.5 cm（图3-a）。WB检测结果显示，在TP309水稻中，对照处理条件下，OsPR1A在8 d内没有OsPR1A的诱导条带出现；在MeJA处理条件下，OsPR1A在接菌第6 天有诱导条带出现，第8天时表达量明显增加（图3-b）。说明外源MeJA处理水稻幼苗可以提前诱导OsPR1A的表达进而增强了水稻对Xoo的抗性。

图3 MeJA处理对病斑长度和OsPR1A表达的影响Fig. 3 Effects on the lesion length and OsPR1A expression of MeJA treatment

2.4 外源MeJA处理的转基因OsPR1a-RNAi水稻对病斑的影响

用100 μmol/L MeJA预处理水稻OsPR1a-RNAi转基因株系351和352，处理48 h后接种Xoo，接菌12 d后观察表型（见图4）。

图4 MeJA处理OsPR1a-RNAi转基因水稻对病斑长度的影响Fig. 4 Effect on the lesion length of MeJA-treated OsPR1a-RNAi transgenic rice

结果发现，MeJA预处理的转基因株系351和352，与未经处理的351和352相比，病斑长度缩短；351+MeJA长度居于4021与351之间（图4-a），352+MeJA长度居于4021与352之间（图4-b）。统计结果发现，MeJA预处理的转基因株系病斑长度显著低于未处理的转基因株系（P＜ 0.05）（图4-c,图4-d）。结果表明，通过外施MeJA，可以减弱OsPR1a-RNAi植株对Xoo的敏感性。

3 讨论与结论

植物的抗性水平受到植物激素介导的系统信号的影响。在双子叶模式植物拟南芥中，植物激素在先天免疫防御反应中发挥着重要作用，因此得到广泛的研究；然而，直到最近10年，在单子叶模式植物水稻（Oryza sativaL.）中才被证实植物激素在免疫反应中起着保守作用［12］。研究表明，JA是抵抗坏死型病原体所必需的，而SA是抵抗生物营养型病原体所必需的［20］。在拟南芥中，JA与SA以拮抗的方式相互作用，JA与ET呈协同作用［21］。在水稻中，OsNPR1作为SA的受体，超表达该基因后JA相关应答基因表达下调，使水稻植株更容易受到昆虫等食草动物的危害［22］。外源MeJA、SA和ET处理水稻离体叶片，OsPR1a基因受到诱导表达，其中MeJA处理的OsPR1a转录水平明显高于SA处理的样品［12］。本研究结果表明，OsPR1A受JA和ET的诱导，而ABA则抑制其表达，SA则以前期有一定的抑制作用。说明OsPR1A可能主要参与在JA介导的信号转导途径中而并非SA途径。研究发现，植物激素ABA主要参与防御反应的调控和整合，ABA可能充当了植物防御的负调节剂［12］。外施ABA或低温处理会降低水稻对稻瘟病的抗性，而外用ABA合成抑制剂处理水稻会阻止低温导致的稻瘟病敏感性［23-24］。水稻OsERF922受ABA快速而强烈地诱导，超表达后防御相关基因（PR1a，PR1b，PR10，PAL）的表达减少，ABA的内源水平增加，并且降低了对稻瘟病的抗性，因此，ABA可能会通过调控OsPR1A在水稻免疫应答中起负调控作用。

本实验室前期研究表明，OsPR1A不仅受Xoo的诱导［6］，而且还受光的诱导［25］。光对植物生命至关重要，对光环境的感知往往是通过激素水平和信号传递的变化影响植物的生长发育。光信号可以通过光敏色素（phy）将信号传递给下游蛋白，激活植物的防御反应。不耐荫植物通过光敏色素B（phyB）激活避荫反应，进而促进与生长相关的激素途径并减弱JA介导的防御反应［26］。在phyAphyBphyC突变体中与野生型水稻相比，JA途径相关基因（LOX2，AOS2）和病程相关基因（PR1a，PR1b）表达水平降低［27］。结合本试验结果，OsPR1A可能参与了光信号引起的JA防御反应，即光-JA-OsPR1A信号途径在植物防御应答中发挥着重要作用。

病程相关蛋白质OsPR1a属于PR1家族成员，编码酸性蛋白质，属于类丝氨酸羧肽酶［12,28］。研究发现，在离体叶片中伤害可以诱导OsPR1a的表达，并且在JA与伤害同时存在的情况下可以强烈的诱导OsPR1a的表达，表明JA可能参与了水稻应对伤害胁迫的防御反应［12,28］。JA处理野生型水稻TP309和转基因水稻OsPR1a-RNAi幼苗后均会降低它们对Xoo的敏感性，呈现一定的抗病性，而OsPR1A超表达转基因纯合植株增强了水稻对Xoo的抗性（待发表）。OsPR1A在水稻苗期地上部不表达，在根中组成型表达，外施MeJA处理后OsPR1A在根部随着时间延长表达量增加。本研究结果表明，水稻在没有受到胁迫的情况下，JA诱导的根部OsPR1A表达可能参与了水稻根系的营养和发育过程。而叶片受到伤害或病原菌侵染时，外源MeJA处理水稻幼苗叶片，会激活叶片在伤害部位或侵染部位获得局部抗性，诱导OsPR1A表达增加，增强了水稻对白叶枯病菌的抗性。

总之，植物的抗病反应是一个综合协调，多因素互作的结果，涉及到光照、温度、生长发育阶段、抗性基因和激素等。以外施MeJA为线索，通过诱导OsPR1A的大量表达，可以进一步梳理水稻抗白叶枯病的信号转导途径中MAPK-WRKY-PR之间的具体关系。通过抗病信号途径的探究，达到获得广谱抗性的方法。