利用渐渗系解析黄瓜心皮数基因CsCLAVATA3调控果实发育的多效性

高 阳，刘 娟，刘一诺，侯非凡，王金耀，邢国明，李 森

（山西农业大学 园艺学院/山西省设施蔬菜产业提质增效协同创新中心，山西 太谷，030801）

黄瓜（Cucumis sativusL.）是世界上重要的蔬菜经济作物，提高单位面积的产量一直是黄瓜育种最重要的目标之一。黄瓜心皮数增多可以显著提高果实单果重［1］，在生产上有着极为重要的意义。

葫芦科的果实大小和性状可能受到果实心皮数（Carpel Number, CN）的影响［2］。CN变异的分子和遗传机制已经在模式植物拟南芥（Arabidopsis thaliana）中进行了广泛的研究，拟南芥CLAVATA途径主要包括3个基因（CLV1,CLV2和CLV3），任何一种基因的缺陷都可能会表现出花和花器官数量增加［3］；在番茄中果实大小的变化也是由于CLV3同 源基因fasciated(fas)以及WUSCHEL同源基因locule number(lc)所引起的［4-6］，其对室数和果实大小有着协同效应［7］；在甜瓜中，心皮数是由pentamerous(p)基因控制的，其研究表明5心皮甜瓜要比3心皮甜瓜更圆［8-10］。在黄瓜中，Li等人确定了CsCLV3是导致黄瓜心皮数目变化的原因，并且提出黄瓜品系果实重量的增加可能是由于Cn位点增加的多效性效应［1］。总体来看，CLV3在植物中所表现出的遗传效应是一致的。

本研究在张亚楠等［11］的基础上，利用其使用轮回母本‘长春密刺’与轮回父本‘True Lemon’构建的BC3F1，进一步自交得到纯合自交系，进行渐渗片段分析、表型差异分析以及数量性状基因座定位（Quantitative Trait Locus, QTL）分析，以期明确黄瓜心皮数基因CsCLV3在调控果实发育上所显示的多效性效应。

1 材料与方法

1.1 供试材料

本试验中CsCLV3近等基因系NIL(TL)构建所用轮回母本‘长春密刺’（CCMC）为华北型黄瓜骨干亲本，轮回父本‘True Lemon’（TL）来自于美国威斯康辛大学黄瓜分子遗传与育种实验室［12,13］（图1）。将CCMC/TL杂交产生的F1与轮回亲本CCMC回交3代得到BC3F1［11］，在此基础上筛选候选单株并自交1次得到本试验所用BC3F2群体。

图1 黄瓜CsCLV3渐渗系轮回亲本CCMC和TLFig.1 Recurrent parents CCMC and TL of cucumber CsCLV3 osmotic lines

1.2 田间试验和性状考察

310个BC3F2单 株 于2019年 夏 天 在 山 西农 业 大 学 园 艺 站 种 植（北 纬37°25′20″，东 经112°34′50″）。从BC3F2单株采取幼嫩叶片，使用改良CTAB法抽提DNA［14］，供心皮数关联标记D1及多态性SSR(Simple Sequence Repeats)标记进行基因型分型［1］。5月10日催芽，5月20日移栽，种植密度为40 cm × 60 cm，田间管理采取一般大田管理。

在果实的整个发育周期中，对心皮数（Carpel Number, CN）、果实长度（Fruit Length, FL）、果实粗度（Fruit Diameter, FD）、成熟单瓜重量（Fruit Weight, FW）、种子数（Seed Number, SN），种子百粒重（Hundred-grain Weight, HGW）等农艺性状进行测定。其中FD测量距离瓜顶三分之一处即瓜肚位置，各性状测定参考见图2。将雌花完全打开的时间定义为0 d，则果实发育时间为-6～40 d，每日早晨8时进行数据测量，3次重复。每个单株上所有果实的表型平均值作为该单株的表型值。数据集选用果实40 d时的各性状表型值，使用EXCEL进行数据整理、GraphPad prism 8.0作图，显著性分析所用软件为DPSv7.05版。

图2 果实农艺性状测定示意图Fig.2 Schematic diagram for determination of agronomic characters of fruit

1.3 渐渗片段分析

1.3.1 SSR 分析 课题组前期基于Yang等发表的黄瓜基因组连锁遗传图谱［15］筛选出了在CCMC与TL间具有多态性的SSR标记95对，这些标记均匀分布于黄瓜的7条染色体中，CsCLV3的图位克隆结果表明其位于1号染色体上［1］，根据Weng等发表的Gy14-V2物理图谱(ftp://cucurbitgenomics.org/pub/cucurbit/genome/cucumber/Gy14/V2/)，对 目 标基因周围进行SSR加密，检测5心皮纯合型与3心皮纯合型以及轮回亲本间的多态性。PCR采用10 μL扩增体系，touchdown反应程序［11］，采用9%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测扩增产物，电泳结束后经银染显色拍照记录检测结果。根据导入系中的标记基因型是否与CCMC相同确定导入系在标记位点上是否携带供体亲本的导入片段，并利用GGT32构建图示基因型［16］。

1.3.2 SNP 分析 在BC3F2群体中选择基因型数据与心皮数表型鉴定数据相一致的植株，即基因型数据为A、心皮数为3的3心皮子代与基因型数据为B、心皮数为5的5心皮子代，2种材料各选5株进行简化基因组测序（Genotyping-By-Sequencing,GBS），利用北京百迈客生物科技有限公司自主 研 发 的SLAF-seq（Specific-Locus Amplified Fragment Sequencing）技术［17］对10个子代进行酶切测序，以黄瓜Gy14-V2基因组作为参考基因组，利用BWA［18］将测序reads比对到参考基因组上，并使用GATK［19］和Samtools［20］2种方法开发单核苷酸多态性标记（Single Nucleotide Polymorphism,SNP），最终取2个软件所得结果的交集。将得到的各材料高质量SNP分别存储在EXCEL文件中，并使用LOOKUP公式筛选差异SNP［12］，最终得到5个5心皮材料相对于3心皮SNP组的差异SNP以及5个3心皮材料相对于5心皮SNP组的差异SNP。使用R/CMplot包［21］绘制5心皮纯合型以及3心皮纯合型的差异SNP密度分布图，以差异SNP所在物理位置来判断其导入片段长度。

1.4 QTL定位

利用141个单株BC3F2群体（不含杂合基因型个体）和CsCLV3所在1号染色体上的多态性SSR标记，构建CsCLV3局部区间的分子标记连锁图，利用R / qtl软件［22］中的em算法对黄瓜6个果实性状CN、FL、FD、FW、SN以及HGW进行QTL定位。使用MapQTL 6.0区间作图法（Interval Mapping,IM）对定位结果进行验证，并计算加性效应及遗传贡献率。

2 结果与分析

2.1 渐渗片段分析

2.1.1 基于多态性SSR标记的渐渗分析 在CCMC/ TL群体，BC3F1回交世代中，4号、5号染色体遗传背景恢复率达到100%，2号、3号、7号染色体恢复率也达到了99%［11］，所以在本研究中重点关注了BC3F2子代在1号、6号染色体上的遗传背景恢复（图3），可以看到，在1号染色体上，10个5心皮子代均在染色体前端有着不同长度的供体片段，在0～10.8 Mb区间内，其渗入片段可以分成两部分，共有片段为UW084475(8.2 Mb) - D1(10.8 Mb)，在UW085383(0.2 Mb) - UW028617(8.0 Mb)区间内，5心皮子代渗入片段在个体间存在差异；10个3心皮子代均不含有D1标记附近供体片段，说明此片段在决定5心皮发育上起到了关键作用，3心皮子代在UW028419(7.7 Mb) - UW028617(8.0 Mb)以及UW046836(8.4 Mb)周围存在2个小片段。在6号染色体上，渗入片段并没有随着心皮的变化而变化，5 心皮子代 B3、B6 在 Chr_6 上的遗传背景恢复率达到了100%，而其余5心皮子代有着不同大小的渗入片段，3心皮子代A1、A7、A8、A9遗传恢复率较高，只在UW039897(20.6 Mb) 周围存在纯和或者杂合小片段，剩余3心皮子代在SSR02021(1.0 Mb)- UWSTS0225(7.8 Mb)内存在纯合或者杂合供体片段。也就是说6号染色体上渗入的供体片段是随机的，不影响对于CsCLV3的遗传效应分析。从全基因组水平来看，渐渗结果较好，3心皮近等基因系与5心皮近等基因系只在目的基因导入区域（1号染色体）以及6号染色体前端存在差异，背景噪音较小，有利于接下来的表型比较。

图3 亲本与部分5心皮、3心皮子代在1号、6号染色体上的SSR基因分型Fig.3 SSR genotype of parents and some 5-carpels and 3-carpels progenies on chromosomes 1 and 6

2.1.2 基于GBS的渐渗分析 基于RsaI + HaeII双酶切策略，本试验测序的10个单株共获得148 626个SLAF标签，标签的平均测序深度为20.30 X，在染色体上分布均匀，在此基础上将clean data比对到参考基因组Gy14-V2，SNP Calling后共得到9 594个群体SNP，其中5个5心皮纯合型子代为5 469个，5个3心皮纯合型子代为4 125个。筛选每个5心皮纯合型单株相对于3心皮纯合型SNP集合的差异SNP以及每个3心皮纯合型单株相对于5心皮纯合型SNP集合的差异SNP，最终获得5心皮纯合型差异SNP共2 797个，3心皮纯合型差异SNP共2 097个。

按照其差异SNP所在物理图谱的位置，筛选1号及6号染色体上的标记，绘制得到图4所示SNP密度分布图。5心皮纯合型子代差异SNP主要集中于1号染色体前端，B1、B2、B3、B4这4个单株在1号染色体10.8 Mb周围表现出了强烈的SNP分布，B2单株SNP密度要低于另外4株，而5株3心皮纯合型子代（A1-A5）在1号染色体上SNP很少。在6号染色体上SNP的分布并没有随心皮数目的变化而变化，渗入片段是随机的，A2、A3、A4、B1在6号染色体上的SNP密度较高。总体来看SNP差异分析与SSR分析的结果一致。渐渗结果较好。

图4 子代差异SNP在染色体上的密度分布图Fig.4 Density distribution map of offspring differential SNP sets on chromosomes

2.2 BC3F2群体6个果实性状分析

2.2.1 表型在群体中的频数分布 本试验利用黄瓜心皮数基因CsCLV3关联标记D1对BC3F2世代310株单株进行了前景选择，结果表明，其中79株为3心皮纯合型，68株为5心皮纯合型，其余163株为杂合型。经卡方检验得χ2= 1.606 5（1∶2∶1），在P＜ 0.05水平，当df = 2时χ2标准值为5.99，符合孟德尔分离定律。在此基础上剔除杂合型以及生长不良单株，最终75株3心皮纯合型以及66株5心皮纯合型应用于大田表型调查。

6个果实性状的表型值频率分布都呈现双峰分布（图5，A-F），其双峰低谷值依次为4.2、34.5 cm、5.7 cm、180粒、390 g和2.15 g，2种基因型的表型值分布于双峰低谷值两侧。在心皮数方面，3心皮纯合型单株大部分表现为3心皮，有少数单株会存在3心皮果实与4心皮果实同时存在的情况，而5心皮纯合型则大多表现为5心皮，少数单株存在4心皮果实、5心皮果实以及6心皮果实同时出现的现象；同时发现5心皮纯合型单株的果实，有着较短的果实长度、较粗的果实粗度、果实重量增大、种子数目变多以及种子粒径变小导致的百粒重减少情况。因此，这个近等基因系BC3F2群体的果实长度、果实粗度、果实重量、种子数目以及百粒重都是由于心皮数目变化所引起的，也就是说，其变异是由心皮数基因CsCLV3调控果实发育的多效性所导致的。

图5 BC3F2群体中纯合基因型单株果实性状频数分布Fig.5 Frequency distribution of fruit traits per plant with pure genotype in BC3F2 population

2.2.2 果实性状间的相关性分析 为了更加明确6个果实性状间的互作关系，进一步分析了它们之间的相关性（表1）。

表1 果实性状间的相关系数Table 1 Correlation coefficient among fruit characters

可以看到，性状两两之间都表现为极显著相关，其中果实粗度与单瓜重量的相关性最高，为0.99，果实长度与单瓜重量的相关性系数为-0.40，说明在相同条件下果实粗度增加对重量的增效程度要远高于果实长度增加对其的影响，心皮数与果实粗度的相关性达到了0.93，间接说明了心皮数目增加对于提高黄瓜果实单果重具有重要意义。另外，心皮数与其余4个性状也表现出了较高的相关性，分别为- 0.72、0.93、0.89、0.91、-0.94，也说明了心皮数基因CsCLV3调控果实发育的多效性。2.2.3 黄瓜心皮数基因CsCLV3调控果实发育的多效性 比对6个果实性状在两种基因型上的差异可以发现（表2），5心皮纯合型的CN比3心皮纯合型多1.8，FD比3心皮纯合型粗1.05 cm，FW比3心皮纯合型重48.57 g，种子数平均比后者多103.01粒，而FL与HGW分别比3心皮纯合型低3.2 cm和0.74 g。黄瓜心皮数基因CsCLV3通过调控黄瓜心皮数目的多少进而对一系列的果实性状产生多效性影响，表明CsCLV3对果实6个性状有较大的遗传效应。

表2 3心皮纯合型与5心皮纯合型果实性状统计Table 2 Statistics of fruit characters of 3 - carpels pure type and 5 - carpels pure type

2.3 果实6个性状QTL定位

利用BC3F2群体141个单株的6个果实性状CN、FL、FD、FW、SN和HGW的表型值，结合已经构建好的黄瓜1号染色体CsCLV3局部遗传连锁图谱进行QTL分析（图6、表3）。6个果实性状均定位到心皮数基因位置，LOD峰值落在心皮数基因关联标记D1位点，R / qtl与MapQTL计算结果一致，其中CN性状LOD值最高，为93.3，解释了心皮数目变异的95.3%。果实重量的加性效应达到-24.29 g，种子数目的加性效应达到了-51.50粒，表型变异幅度较大，种子数目QTL解释了其变异的87.9%，其余表型性状FL、FD、FW、HGW，对应QTL分别能解释其表型变异的55.2%、89.7%、83.2%、93.9%。

图6 BC3F2群体6个果实性状的QTL峰值曲线Fig.6 QTL peak curve of six fruit traits in BC3F2 population

表3 BC3F2群体6个果实性状的QTL定位Table 3 QTL mapping of six fruit traits in BC3F2 population

3 讨论与结论

本研究基于正向遗传学的思路，通过构建心皮数基因CsCLV3近等基因系来进一步探索其调控果实发育的多效性。近等基因系的好处在于其与受体亲本之间只有代换片段的差异，这样可以减少非目的基因对于试验结果的影响，在抗性育种方面，Jena等通过构建25个水稻近等基因系为抗褐飞虱育种提供了新的遗传资源［23］；在QTL定位方面，Guan等利用多个近等基因系精确定位并验证了小麦染色体4AL上控制其千粒重的主效数量性状基因座［24］；在基因功能研究方面，Glagoleva等应用转录组学与代谢组学联合分析的方法，利用大麦近等基因系，阐明了其黑外种皮基因的代谢途径及遗传效应［25］。本研究利用5心皮黄瓜‘True Lemon’以及3心皮黄瓜‘CCMC’构建了黄瓜心皮数近等基因系，用于自交的BC3F1世代遗传背景大约98%是纯和CCMC［11］，背景噪音较小，SSR分析与SNP分析也证实了这一点，在此基础上得到的BC3F2群体能够准确地判断心皮数基因CsCLV3对于果实发育的效应。

通过分子标记辅助选择可以极大的加快常规育种进程，Wang等使用MAS策略将高抗褐飞虱基因导入水稻优良品种9311，育成高抗近等基因系［26］；Kang等使用MAS加速了抗条纹叶枯病近等基因水稻品系的构建［27］；谭聪等使用一个BC2F2群体对Ghd7调控水稻剑叶面积的多效性进行了一系列研究，在判断BC2F2群体基因型时必须依靠BC2F2:3家系才能够对上一世代基因型做出判断［28］。本研究基于前期开发的心皮数关联标记D1［1］以及多态性SSR标记［11］，可以快速的进行前景选择和背景选择，在BC3F2群体尚在幼苗时期就可以对其基因型以及遗传背景做出鉴定，只保留了群体中的3心皮子代以及5心皮近等基因系，过滤掉了杂合型单株，节省了人力物力。

葫芦科果实的大小、形状可能受到植物性别表达以及果实心皮数（CN）的影响［2］，在本研究中，构建CsCLV3近等基因系的过程中已经排除掉了黄瓜两性花位点（m位点）［29］，BC3F2群体中3心皮纯合系与5心皮纯合系只有心皮数位点（Cn位点）上的差异。6个果实性状的表型值均呈现为双峰分布，这符合F2群体中表型数据的分布特征，证明了表型数据的可靠性，其中3心皮纯合型与5心皮纯合型在各性状都存在着很明显的差异。心皮数目与果实粗度（r = 0.93，P＜ 0.01）、单瓜重量（r = 0.89，P＜ 0.01）、种子数目（r = 0.91，P＜ 0.01）这3个性状均为极显著正相关，与果实长度（r = -0.72，P＜ 0.01）、百粒重（r = -0.94，P＜ 0.01）这2个性状极显著负相关，这与Pan等的描述一致，CN较高的植株表现出略低的FL，以及较高的FD，FD表型的变异可以归因于Cn位点的多效性效应［2］。当心皮数目增加时，其果实内部腔室增多，用于供给种子养分的侧膜胎座空间增加，致使种子数量增多，也正是由于这种发育情况，种子粒径变小，其百粒重下降。

在QTL定位方面，本研究中的6个果实性状均定位到了心皮数关联标记D1上，CN、FL、FD、FW、SN和HGW对应QTL贡献率分别为95.3%、87.9%、55.2%、89.7%、83.2%、93.9%，解释变异的程度都比较高。

性状间的相关性以及QTL定位的结果都说明了这6个性状的变异是由Cn基因座引起的心皮数目变化所导致的，这些变异也与心皮数基因CsCLV3共分离。