韭菜籽黄酮的微波辅助提取及其抗氧化活性研究

李敬，尤颖，吕惠丽

(河北经贸大学 生物科学与工程学院，石家庄 050061)

韭菜籽含有硫化物、黄酮、维生素C等多种活性成分[1-2]，具有温补肝肾等功效[3]，是我国中医药学中的常用药材之一，于《名医别录》中有所记载，其性温，味辛，为激性剂，具有较高的药用价值。作为药食同源的植物种子，韭菜籽还常被制成调味品，用于增加食品的辛辣程度。韭菜籽资源丰富，但是目前韭菜籽的开发利用却十分有限，只有少部分用于医学研究和种子保护，造成韭菜籽资源的浪费。

近年来，国内外的相关学者对韭菜籽的组成成分、药理作用等方面做了进一步深入的研究，虽然对韭菜籽药理学方面的研究较为深入，但对于其某种具体的活性成分提取工艺的研究较少，如总黄酮类化合物。黄酮类化合物具有多种功效，因此应用广泛。在医药方面，白莉等[4]在最新的研究中发现，韭菜籽总黄酮具有缓解痛经的作用；在功能性食品应用方面，黄酮类化合物可作为食品添加剂原料，制成天然抗氧化剂、天然着色剂、天然增味剂等食品添加剂。目前从植物中提取黄酮类化合物常用溶剂提取法[5-7]，因乙醇无毒，不会引起人体不适，故工业上常用乙醇作为提取剂，但提取时间过长。

本试验以韭菜籽为主要原料，采用微波辅助提取法从韭菜籽中提取总黄酮类化合物，通过正交试验来确定韭菜籽总黄酮的最佳提取工艺，并研究其抗氧化性，为韭菜籽资源的合理利用及开发天然抗氧化剂提供了科学依据。

1 材料与设备

1.1 材料与试剂

韭菜籽：购自S.A.申奥中药材店铺；芦丁标准品、亚硝酸、硝酸铝、氢氧化钠、无水乙醇、水杨酸、硫酸亚铁、过氧化氢：以上试剂均为分析纯。

1.2 试验设备

LK-600A中药粉碎机 上海新诺仪器设备有限公司；722分光光度计 上海菁华仪器有限公司；BS-2239分析天平 北京赛多利斯仪器系统有限公司；JOYNH1C1微波炉 佛山市顺德区格兰仕微波炉电器有限公司；9240MBE电热干燥箱 上海博讯实业有限公司。

2 试验方法

2.1 韭菜籽总黄酮的测定方法

2.1.1 韭菜籽预处理

韭菜籽在105 ℃的温度下恒温干燥4 h，磨碎后过筛，备用。

2.1.2 配制标准溶液

本试验用分析纯芦丁标准品作为黄酮化合物，制作标准溶液。

备用液的配制：取两个100 mL容量瓶，分别编号A，B。精确称取0.1 g芦丁标准品，将其溶于体积浓度为80%的乙醇溶液中，将其移入A中定容。将A中溶液作为备用液。精确移取A中溶液10 mL于B，然后用体积浓度为30%的乙醇溶液定容至刻度，混匀。此时即获得了浓度为0.1 mg/mL的芦丁标准液。

2.1.3 绘制芦丁标准曲线

向6支比色管中分别加入0.5，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0 mL的芦丁标准液，用30%乙醇补充至5 mL。分别向比色管中加入0.4 mL 5%的亚硝酸钠溶液，混匀。静置后加0.4 mL 10%硝酸铝溶液，混匀后加4 mL 4%氢氧化钠溶液，不足10 mL的用水补齐，静置15 min。在510 nm处测定吸光度值，制作标准曲线。

2.1.4 提取韭菜籽总黄酮

取磨好的韭菜籽粉5 g于烧杯中，按比例加入配制好的乙醇溶液，使用微波法进行提取[8]。离心、取上清液备用。

2.1.5 计算韭菜籽总黄酮提取率

取上清液1 mL，测定吸光度值，代入标准曲线方程得总黄酮浓度，按下式计算其提取率[9-11]：

2.2 单因素试验

将指标设定为韭菜籽总黄酮提取率。准确称取5 g韭菜籽粉，与不同的乙醇体积浓度混合，在不同微波时间、料液比和微波功率情况下进行提取。

2.2.1 乙醇浓度对提取率的影响

设定乙醇浓度分别为40%、50%、60%、70%，在料液比1∶20、微波时间3 min、功率350 W的条件下，从韭菜籽中提取总黄酮。

2.2.2 微波时间对提取率的影响

从经济和工艺操作两方面考虑，选择最佳的微波时间。本试验采用的微波时间分别为2，3，4，5 min，将乙醇浓度设定为60%、微波功率设定为350 W、料液比设定为1∶20进行提取。

2.2.3 料液比对提取率的影响

提取溶液乙醇的添加量会对提取率产生影响，选取合适的料液比可以增加总黄酮的提取量[12-14]，提升其提取效率，同时节约药品成本，减少资金投入，更加适于大规模推广。设定乙醇浓度60%、微波时间4 min、功率350 W，料液比分别为1∶10、1∶20、1∶30、1∶40进行提取，考察料液比对提取率的影响。

2.2.4 微波功率对提取率的影响

考察210，280，350，420 W 4个功率对提取率的影响。在60%乙醇、料液比1∶20、微波时间3 min的条件下进行提取。

2.3 正交试验

根据单因素试验结果设计正交试验，见表1。

表1 正交试验因素水平表

2.4 测定抗氧化性试验

2.4.1 清除DPPH·自由基试验

DPPH·自由基可以稳定地存在于有机溶剂中，在乙醇溶液中呈现深紫色。当存在某些物质可以与其所带的单电子配对时，DPPH·自由基将失去氧化性。因此，根据DPPH·自由基的这一特性可以测定韭菜籽总黄酮的抗氧化性。DPPH·自由基经配对后颜色变浅，吸光度也因此降低，并且其最大吸收波长为517 nm，所以选择在此波长处采用分光光度法测定韭菜籽总黄酮对DPPH·的清除率[15]。

称取0.0204 g DPPH·，用无水乙醇溶解，在容量瓶中定容，摇匀。取6支10 mL容量瓶，分别编号1～6。在1～6号瓶中分别加入0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，1.2 mL本试验提取的韭菜籽总黄酮，用无水乙醇定容。将1～6号瓶中溶液作为样液测定其对DPPH·的清除率。取6支10 mL比色管，分别编号1～6，均加入2 mL DPPH·溶液，从1～6号瓶中取2 mL样液分别加入1～6号比色管中，充分振荡后，避光静置30 min，测定其在517 nm处的吸光度，记为A1～A6。计算DPPH·自由基清除率，公式如下：

式中：A0为2 mL DPPH溶液与同体积乙醇的吸光度；Ai为2 mL DPPH溶液与同体积总黄酮的吸光度；Aj为2 mL无水乙醇溶液与同体积总黄酮的吸光度。

2.4.2 清除·OH自由基试验[16]

分别取不同浓度样液1 mL，加入1 mL 5 mmol/L水杨酸、1 mL 5 mmol/L FeSO4，混匀后加入1 mL 5 mmol/L H2O2，37 ℃反应0.5 h，在波长510 nm处测定吸光度。利用蒸馏水作为参比(若溶液不足4 mL时用蒸馏水补足至4 mL)。总黄酮对羟基自由基(·OH)清除率的计算公式如下：

3 结果与讨论

3.1 芦丁溶液标准曲线

由芦丁标准曲线图(见图1)可得标准曲线方程为：y=11.204x+0.0196(y为芦丁溶液浓度，mg/mL；x为吸光度值)，均方差R2=0.9658。

图1 芦丁溶液标准曲线

3.2 各单因素对总黄酮提取率的影响

3.2.1 乙醇体积浓度对提取率的影响

由图2可知，乙醇浓度为40%～60%时，提取率随浓度增加而增加，最大值为0.16‰。但乙醇浓度若继续增加，提取率下降。原因是乙醇浓度过大时，韭菜籽中其他醇溶性物质溶解量增加，导致总黄酮提取率下降。因此，选取乙醇浓度40%、50%、60% 3个水平进行正交试验。

图2 乙醇浓度对韭菜籽总黄酮提取率的影响

3.2.2 微波时间对提取率的影响

由图3可知， 总黄酮提取率随着微波时间的增加出现先上升后下降的趋势。在4 min时提取率最高，若微波时间继续增加，提取率开始下降，可能是随着微波时间的增加，总黄酮类物质发生了氧化反应，导致提取率下降。因此，选取微波时间3，4，5 min 3个水平进行正交试验。

图3 微波时间对韭菜籽总黄酮提取率的影响

3.2.3 料液比对提取率的影响

由图4可知，随着料液比的增加，提取率先增大后减小。当料液比为1∶20时，提取率最高，为0.92‰。因此，最佳料液比为1∶20。

图4 料液比对韭菜籽总黄酮提取率的影响

3.2.4 微波功率对提取率的影响

由图5可知，总黄酮提取率先随着微波功率的增加而增加，在350 W时最高，为0.44‰，但功率超过350 W时，提取率下降。这可能是由于微波功率过高，破坏了韭菜籽总黄酮的结构。因此，选取微波功率280，350，420 W 3个水平进行正交试验。

图5 微波功率对韭菜籽总黄酮提取率的影响

3.3 正交试验结果

根据正交试验结果(见表2)，韭菜籽黄酮的最佳提取工艺为：料液比1∶20，乙醇浓度60%，微波时间4 min，功率350 W，此时总黄酮提取率为76.36‰。

表2 正交试验结果

续 表

运用微波提取技术提取总黄酮的依据是，韭菜籽粉吸收微波后其中的偶极子会发生旋转、离子进行传导，使得体系中分子的膨胀频率急剧增加，在这种情况下，总黄酮分子极易从韭菜籽内部扩散到提取液乙醇溶液中，从而将韭菜籽总黄酮提取出来。在最佳提取条件下，本试验的韭菜籽总黄酮提取率为76.36‰，与郭奎彩等[17]采用超声提取法从韭菜籽中提取总黄酮的得率为5.71‰相比，本试验的提取率更高，同时能有效地降低生产成本，操作过程安全可靠，可以在未来进行大规模推广，广泛应用于工业生产中。

3.4 韭菜籽总黄酮的抗氧化性

3.4.1 DPPH·清除能力

由图6可知，韭菜籽总黄酮对DPPH·的清除作用明显，清除率随着总黄酮浓度的增加而增加，当总黄酮浓度为0.034 mg/mL时，清除率达到82.36%。

图6 不同浓度韭菜籽黄酮对DPPH·的清除率

3.4.2 ·OH清除能力

由图7可知，随着韭菜籽总黄酮浓度的增加，其对·OH自由基的清除能力增强，总黄酮浓度在0.0057～0.0342 mg/mL之间时，·OH自由基的清除率为40.98%～61.20%，说明韭菜籽总黄酮的抗氧化能力较强。

图7 不同浓度韭菜籽黄酮对·OH的清除率

4 结论

总黄酮不仅能控制有害菌的生长，还能有效防止食品氧化，是目前国内外研究的热点之一。本试验采取微波辅助提取法从韭菜籽中提取总黄酮，旨在确定韭菜籽总黄酮的最佳提取工艺，并探索韭菜籽总黄酮的抗氧化性。结果表明，韭菜籽总黄酮的最佳提取工艺为：60%乙醇，微波时间4 min，料液比1∶20 (g/mL)，功率350 W。此外，韭菜籽总黄酮对DPPH·和·OH有一定的清除作用，并且在试验所选择的范围内，抗氧化能力随着韭菜籽总黄酮浓度的增加而加强，表明韭菜籽总黄酮可以作为天然的食品抗氧化剂及防腐剂。如今社会越来越重视天然产品，韭菜籽总黄酮作为一种纯天然、无公害的提取物，不仅可以作为天然着色剂、天然增味剂等食品添加剂原料，还可以将其应用于对人体起抗衰老作用的功能性食品中，在功能性食品应用方面有广阔的发展空间。