克东腐乳的研究进展

范洪臣，王冰，马永强

(哈尔滨商业大学 省高校食品科学与工程重点实验室，哈尔滨 150076)

腐乳因鲜美的味道、细腻的口感、独特的风味、多样的品种和丰富的营养，被国外誉为“东方奶酪”，是微生物发酵白豆坯而成的传统食品[1]。根据颜色、风味与辅料的不同可将腐乳分成4大类：红腐乳、白腐乳、青腐乳和其他类型腐乳[2]。腐乳中含有大量的蛋白质、多种氨基酸、矿物质和维生素等营养物质，营养价值较高[3]。根据菌种类型可将腐乳分为毛霉、根霉、细菌腐乳以及无菌腐乳[4]。黑龙江克东腐乳作为一种细菌型腐乳，在国内众多腐乳中独树一帜，具有明显的地域特色，与霉菌型腐乳相比，含有大量鲜味的氨基酸，更加鲜美的滋味、鲜艳的色泽，质构和风味有很大的区别[5]。本文对近些年细菌型发酵腐乳的代表——克东腐乳在生产工艺、微生物、酶、化学组分、风味、营养研究方面做一总结，并对克东腐乳的研究方向进行展望，为细菌型发酵腐乳的科研和生产提供了借鉴。

1 克东腐乳生产工艺

克东腐乳以黑龙江地产非转基因大豆为原料，以微球菌为生产菌种，经过多道工序，长达6个月发酵，生产出的产品具有鲜艳的色泽、清香的味道、细腻柔软的质地和丰富的营养。克东腐乳富含蛋白质及多种氨基酸，其中人体必需的氨基酸就有8种；富含多种维生素及微量元素，如钙、铁、锌、硒等，是非常好的佐餐食品。克东腐乳加入了中草药，产品亦有健脾补阳、温中散寒、开胃止胀、解膻去腻、增进食欲、帮助消化等特点[6]。克东腐乳同其他发酵工艺类似，生产工艺流程见图1。

图1 克东腐乳生产工艺

腐乳生产过程复杂，包括一系列的物理化学和生物化学反应。从大豆的筛选、浸泡、磨浆、滤浆、煮浆，以酸或盐点浆，到豆浆凝固后经压榨沥水成豆腐，然后切成适当的小块成为白坯，都属于物理化学过程[7]；白坯接种上微生物，经过微生物的前酵和后酵，产生特殊的质构和风味，此阶段微生物生长代谢发生多种反应都属于生化反应过程。腐乳的前酵过程包括菌种繁殖和酶解两部分，菌种经一段时间生长繁殖后在白坯表面形成致密的菌膜，分泌的酶可将原料分解成蛋白质、肽、氨基酸和多糖等前体物质，为后酵提供原料[8]；后酵过程主要包括加盐腌制和添加酒精辅料进行熟化两部分，耐高渗透压和酒精的多种微生物继续降解坯体中蛋白质大分子物质，生成小分子肽、氨基酸及其他产物，与辅料中的化学物质协同作用生成醇、醛、酸、酯等呈香化合物，经过发酵后熟，腐乳形成了特有的色、香、味、体。

2 克东腐乳微生物研究

克东腐乳已有百余年历史，其生产工艺以细菌型发酵而独具特色。克东腐乳中菌种的确定与多样性的研究经历了一个漫长的过程，研究的方法主要有传统微生物分离方法和变性凝胶电泳技术。

白虹等利用传统的微生物分离方法，在25 ℃、pH 7.0液体发酵培养条件下，从克东腐乳中分离纯化出3株菌，检测其生长及产酶活力。微生物学研究表明菌A，B均产蛋白酶，A为革兰氏不定型芽孢杆菌，B为革兰氏阳性芽孢杆菌；菌C不产蛋白酶，为革兰氏阳性微球菌[9]。此结论与王润芝等研究的克东腐乳主要微生物类群是细菌的结论一致[10]。

平板分离鉴定微生物是传统食品发酵微生物研究的主要手段，从样品中筛选出纯菌株后进行生理生化鉴定，确定样品中存在的微生物种类及数量[11]。由于腐乳微生物复杂多样，该方法只能筛选特定条件下的可培养微生物，占比例很大的不可培养微生物被忽略。因此，仅靠传统培养方法不能全面揭示腐乳微生物的菌群结构。变性凝胶电泳技术克服了难培养或不可培养的新菌无法被研究和利用的缺点，能够高效地获取样品中微生物群落指纹和特征性核苷酸序列，突破了腐乳中微生物多样性研究的瓶颈，成为微生物多样性和菌群结构变化的分子检测技术之一，广泛用于传统食品发酵微生物多样性的研究[12]。

冯镇采用传统平板分离技术和变性凝胶电泳技术研究了克东腐乳菌群的多样性，采用传统平板分离技术分离并鉴定出22种细菌，采用变性凝胶电泳技术鉴定出27种细菌，这两种方法共同指出禽肠球菌(Enterococcusavium)、粪肠球菌(Enterococcusfaecalis)、肉葡萄球菌(Staphylococcuscarnosus)是菌群中的主要优势菌，肠膜明串珠菌(Leuconostocmesenteroides)、腐生葡萄球菌(Staphylococcussaprophyticus)、巴黎链球菌(Streptococcuslutetiensis)、玫瑰色库克菌(Kocuriarosea)、克氏库克菌(Kocuriakristinae)、短小芽孢杆菌(Bacilluspumilus)、蜡样芽孢杆菌(Bacilluscereus)和枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)是亚优势菌。肉葡萄球菌(Staphylococcuscarnosus)、腐生葡萄球菌(Staphylococcussaprophyticus)、玫瑰色库克菌(Kocuriarosea)、克氏库克菌(Kocuriakristinae)属于凝固酶阴性球菌，凝固酶阴性球菌很重要，因为这些细菌具有亚硝酸盐和硝酸还原酶活性，促进腐乳红色的形成和稳定，限制了脂质氧化和防止酸败。粪肠球菌(Enterococcusfaecalis)是克东腐乳菌群中的优势菌，它也出现在奶酪和霉菌发酵的腐乳中，它是争议比较大的一种菌，有些研究者认为该菌是受粪便污染的指示菌，另一方面有些研究人员也认为该菌影响着发酵产品的重要风味和作为生物保护剂。蜡样芽孢杆菌(Bacilluscereus)和枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)是亚优势菌，这两种菌是意大利发酵香肠中的优势菌，这些芽孢菌有高的蛋白酶和脂肪酶活性，并且很多研究者认为这两种菌对人体的健康是有益的，因此这两种菌可以作为克东腐乳的发酵剂[13]。

3 克东腐乳中酶的研究

腐乳酿造是由微生物主导的复杂的生化过程，微生物与其分泌的酶对腐乳口感和风味的形成、积累有重要的影响，尤其是多种蛋白酶、脂肪酶的相互协同作用。腐乳发酵过程中各地区微生物、发酵条件、发酵时间不同，产生的酶及性质也不同，所以各品牌腐乳的口感和风味差别也较大。

孙冰玉等以克东腐乳为研究对象，对其生产过程中碱性蛋白酶、中性蛋白酶以及谷氨酰胺酶活力进行监测并分析，结果表明：在腐乳前酵阶段，坯体中碱性蛋白酶、中性蛋白酶及谷氨酰胺酶活力随时间的增加而升高；在腐乳后酵阶段，坯体和汤汁中碱性蛋白酶的活力随时间的增加而下降，中性蛋白酶的活力随时间的增加而升高，而汤汁中谷氨酰胺酶活力略有上升，坯体中谷氨酰胺酶的活力变化不显著[14]。

4 克东腐乳生产过程中化学组分的变化

克东腐乳前酵过程中，占主要地位的微球菌及其他菌在白坯上生长繁殖，相互协同作用分泌并积累蛋白酶、脂肪酶，从而对原料中的蛋白质、脂肪进行水解，为后酵提供前体物。克东腐乳后酵过程中，菌的自溶、酶的分解作用、复杂的生物化学贯穿始终。菌体自溶及酶分解蛋白质形成的胨、多肽和氨基酸，微生物代谢产生的有机酸、醇类和酯类等，这些成分最终赋予了腐乳特殊的质构和风味。

邹丽宏等以克东腐乳为研究对象，通过后酵生产过程中化学组分的变化，揭示各组分的变化规律，结果表明：在腐乳后酵阶段，随着发酵时间的增加，发酵导致坯体中的粗蛋白、粗脂肪含量下降，但汤汁中的粗蛋白、游离脂肪酸含量上升；坯体及汤汁中游离氨基酸态氮、总酸含量、还原糖含量上升；坯体及汤汁中pH下降；食盐含量恒定，而水分含量变化明显[15]。

5 克东腐乳挥发性风味研究

风味是腐乳品质和可接受性的重要感官属性之一，挥发性风味成分是腐乳特殊风味的主要来源，主要由醇、酮、酸、醛、酯、醚和其他化合物组成，腐乳中除了挥发性风味物质还有非挥发性风味物质，如氨基酸、脂肪酸和呈味肽等，这些成分主要由微生物的氨基酸代谢、脂代谢、氧化还原反应、乙醇发酵、酸发酵、Strecker降解和美拉德反应形成[16]。目前克东腐乳中风味物质的提取方法有蒸馏-萃取法和固相微萃取法。

孙菁赫采用蒸馏萃取法提取挥发性风味物质，并结合气相色谱-质谱联用(GC-MS)技术对白坯、坯体和汤料的挥发性风味物质进行检测，综合分析了挥发性风味物质的种类及含量变化，结果表明：随着发酵时间的增加，酸、醛、酮、醇等挥发性风味物质的种类和含量都增加；酯类是主要的风味物质，但酯类物质所占的百分比呈下降趋势。

解春芝采用GC-MS技术测定8种腐乳样品的游离脂肪酸谱，比较其游离脂肪酸的差异，并通过主成分分析法对其进行评价，结果表明：不同类型腐乳中，总游离脂肪酸含量为8.09～18.85 g/100 g，且存在显著差异；共检测出15种游离脂肪酸，亚油酸43.36%～50.74%、油酸22.29%～28.16%和棕榈酸10.99%～13.72%为主要脂肪酸；这3种主要脂肪酸占总游离脂肪酸的98.71%，按游离脂肪酸含量的分值，克东腐乳在8种腐乳中排在第2位。究其原因：一方面，原料大豆和辅料中脂肪及游离脂肪酸含量存在差异，如克东腐乳主要以东北春大豆为原料，自然发酵型腐乳主要以云贵高原夏大豆为原料，而毛霉型腐乳由于分布广泛，其原料的来源也较为多样，包括黄淮海平原和长江流域夏大豆等；另一方面，不同腐乳的微生物区系不同，脂肪酶活力具有差异，进而导致脂肪的降解程度也不尽相同[17]。

6 克东腐乳营养成分及功能性研究

腐乳中功能性物质包括活性肽、不饱和脂肪酸、游离型大豆异黄酮以及不同种类的维生素和矿物质等。原料中的蛋白质和淀粉在微生物作用下发生改变，蛋白质和淀粉分别被分解成氨基酸、多肽和单糖、低聚糖，这些小分子化合物易被人体吸收，营养价值较高[18]。对克东腐乳的营养成分与功能性研究较少，目前只有王鹤霖等对克东腐乳中低聚肽进行了研究。王鹤霖分离、纯化了克东腐乳中低聚肽，对其进行了抗氧化活性研究，结果表明：低聚肽分子量越大，抗氧化活性越强，低聚肽清除自由基能力最大可达38.68%，脂质体系抗氧化能力最大可达0.397 mg/kg[19]。

7 克东腐乳研究展望

克东腐乳是细菌发酵食品，同大多数霉菌发酵的腐乳相比，研究性论文数量较少。霉菌型腐乳在以下研究方面都有很大进展：氨基酸、多肽、不饱和脂肪酸、短链脂肪酸、B族维生素、大豆皂苷、大豆异黄酮等营养物质与功能的研究[20-25]；毛霉和根霉发酵条件对酶的影响[26]，蛋白酶与脂肪酶之间的相互关系[27-28]，酶活性变化[29]；霉菌型腐乳风味物质组成及变化规律[30-32]；毛霉和根霉发酵对腐乳品质的影响[33-34]；菌种多样性的研究，尤其是高通量基因测序技术对腐乳菌群及风味之间关系的研究[35-38]。黑龙江克东腐乳地域特色明显，与霉菌型腐乳相比，因较高的氨基酸含量使其滋味更加鲜美、质地柔软而绵长；发酵过程中细菌代谢与霉菌代谢有很大的区别。因此，克东腐乳可以借鉴霉菌型腐乳的研究方法，在营养物质与功能、酶、风味物质、微生物组成与多样性方面积极开展研究。