番茄产后灰霉病的病原鉴定及生物防治

沈 艳，何鹏搏，何鹏飞，吴毅歆，孔宝华，李兴玉，Shahzad Munir，何月秋

（云南农业大学省部共建云南生物资源保护与利用国家重点实验室，昆明 650201）

0 引言

番茄为茄科番茄属一年生或多年生草本植物，是全球栽培最广、消费量最大的蔬菜作物。中国是世界最大的番茄生产和消费国家，番茄生产是农民增收致富和出口创汇的重要产业[1-2]。连年栽培导致番茄病害越来越严重[3]。其中，番茄灰霉病是北方地区番茄生产中常见、高发的病害之一，塑料大棚、温室、露地栽培均严重发生的病害[4]。灰葡萄孢菌产孢量大、寄主范围广泛，可为害茄科、葫芦科、蔷薇科等470多种植物[5]，该菌不仅在作物生长期间，而且在采后储藏、运输过程中也会引起灰霉病严重发生[6]，给番茄的采后处理、贮藏保鲜等环节带来了极大困难，造成的损失一般为20%～40%，严重时达60%[7]。目前，在果蔬的储藏过程中主要还是采用物理防治和化学防治来控制采后病害，而前者操作难、要求设备可靠，后者污染严重。生物防治具有安全、有效、无残留等生产优点，具备可持续、环保、简便与低能耗等技术优势，是保障农业可持续发展和粮食生产的有效措施[8]，已成为当今研究的热点。研究发现，用于防治番茄灰霉病的生防菌有绿僵菌、链霉菌、酵母菌、木霉、假单胞杆菌和芽孢杆菌[9-11]等，而用于番茄产后灰霉病的防治除拮抗酵母[12-13]外却鲜有报道，酵母菌在采后果实病害的防治中虽已初具成效，但其生防效力有限[14]。芽孢杆菌被用于防治鳄梨、苹果和脐橙等采后病害[15]，但未被证实用于防治番茄产后灰霉病的可靠性。

解淀粉芽胞杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)B9601-Y2(Y2)，是笔者所在实验室从小麦根系土壤中分离到的一株生防菌，有很好内生能力，对水稻稻瘟病菌、水稻纹枯病菌、小麦根腐病菌、马铃薯晚疫病菌等30余种重要植物病原真菌有很强的抑制作用[16，17]。贝莱斯芽胞杆菌(Bacillusvelezensis)DJB5，是球花石斛的内生菌，它既能抑制黄曲霉病原菌又能降解黄曲霉毒素，具有抑制、脱毒双重功能和防治黄曲霉污染的应用潜力[18]。为探索Y2和DJB5防治番茄产后灰霉病的可行性，从云南省姚安县贮藏期采集疑似感染番茄灰霉病的果实，采用组织分离法分离和鉴定病原菌，并以Y2和DJB5开展生物防治研究，以期为番茄产后灰霉病的生物防治提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 试验时间、地点

试验于2018年12月—2019年5月在云南农业大学省部共建云南生物资源保护与利用国家重点实验室进行。

1.2 供试材料

番茄灰霉病菌疑似菌株FQ-2、生防菌株Y2、DJB5均由笔者所在实验室分离和保存。番茄品种为‘瑞粉882’。培养基为PSA和LB。

1.3 试验方法

1.3.1 病原菌分离 从云南省姚安县番茄种植基地冷库中采集罹病番茄果实，在超净工作台上，采用组织分离法分离病菌。将番茄病果用75%乙醇表面消毒和灭菌水清洗后，用解剖刀在病果的病健交界处切取3 mm×3 mm的组织块，接种到含有硫酸链霉素(40 μg/mL)的PSA平板培养基上，放置于20℃恒温培养箱内暗培养，待组织长出白色絮状菌丝，使用接种针挑取菌落边缘的菌丝块转接到新配制的PSA平板上进一步纯化，从而获得番茄病样组织上的疑似病原菌，将其命名为FQ-2，置于4℃冰箱保存备用。

1.3.2 菌株的制备

（1）接种体的制备。将疑似病原菌FQ-2、生防菌Y2和DJB5活化备用。用5 mm打孔器在已活化的病原菌平板上打孔，制备菌饼。在PSA平板上培养病菌孢子，用无菌水清洗，收集孢子悬浮液并用血球计数板计数，制成浓度为1.0×102cfu/mL的孢子悬浮液，备用。挑取Y2和DJB5单菌落转接入新鲜无菌液体LB培养基中，37℃、180 r/min振荡培养72 h，获得发酵液，加入适量的无菌水将菌体浓度调整至1×106、1×107、1×108cfu/mL，备用。

（2）病原菌接种鉴定。将无病番茄果实用75%乙醇表面消毒并灭菌水清洗3次后晾干。用灭菌牙签在番茄果实表面扎直径1～2 mm小孔，放入含有孢子悬浮液的干净烧杯中浸泡，或将灰霉病菌FQ-2菌饼菌丝面朝下扣在备用的番茄果实伤口上，对照不浸泡孢子悬浮液或不接菌饼。把处理过的番茄果实置于20℃恒温培养箱中光照黑暗各12 h交替保湿培养，观察和记录番茄果实的发病情况。

1.3.3 病原菌的形态及分子鉴定

（1）病菌形态鉴定。使用接种针挑取少量FQ-2的菌丝体制作玻片，显微观察病原菌的菌丝体及孢子形态。使用无菌水洗下病原菌的分生孢子，在AX10型光学显微镜(ZESS)200倍镜下观察病菌的分生孢子形态，并用Mshot数字成像系统测量300个分生孢子长宽直径。

（2）基于rDNA-ITS扩增及测序的分子鉴定。使用无菌玻片从长满FQ-2菌丝的PSA平板上刮取菌丝体（约200.0 mg），分别转入2 mL无菌离心管内，向其中加入400 μL/管EDTA(pH 8.0)，随后使用无菌的铁质研磨棒将其捣碎成匀浆状，再补加入200 μL/管EDTA(pH 8.0)，余下提取步骤参考文献[19]。

使用真菌的ITS通用引物ITS1(5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3')和 ITS4 (5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3')扩增上述真菌的部分ITS1-5.8S-ITS4区域，预计扩增片段大小为750 bp。按如下比例配制PCR体系(20 μL)：无菌ddH2O 13.7 μL，10×EasyTaq Buffer(Mg2+)2.0 μL，5 mmol/L dNTPs 1.6 μL，引物2.5 mmol/L的 ITS1和ITS4各1.0 μL，Taq DNA聚合酶(5 U/μL)0.2 μL，FQ-2基因组DNA 0.5 μL(50 ng)。PCR扩增程序：94℃预变性4 min 30 s；94℃变性30 s，55℃退火40 s，72℃延伸50 s，30个循环；72℃最终延伸10 min，16℃保存。PCR结束后，取5.0 μL PCR产物点样于1.0%琼脂糖凝胶的胶孔内，90 V电泳40～50 min，检测有无靶标条带的出现。随后将PCR产物送交昆明擎科生物科技有限公司测序。

结合病菌形态和测序数据与NCBI的GenBank数据库中的同源序列BLAST比对的结果，鉴定出上述病原真菌的种属分类地位。选取一致性较高的同源序列，并以亲缘关系较为疏远的菌株作为组外参比对象(outgroup)，使用MEGA 5.0软件，利用邻接法运行Clustal W，构建系统发育树。

1.3.4 Y2和DJB5对番茄果实灰霉病的预防试验 在超净工作台中，用灭菌牙签在消毒清洗干净的番茄果实表面均匀地扎直径1～2 mm小孔6个，分别放入制备好的Y2或DJB5浓度为1×106、1×107、1×108cfu/mL的菌液中浸泡5 min，晾干后，再分别于0、1、2、3、4和5天在FQ-2 1.0×102cfu/mL的孢子悬浮液中浸泡15 s，取出于室内晾干（约30 min），每个处理5个果实，4次重复，以不浸泡Y2或DJB5菌液的果实为发病对照，以不接致病菌和Y2或DJB5菌液的果实为完全空白对照，在接种后的第10天，调查番茄果实病情并拍照记录。

1.3.5 Y2和DJB5对番茄果实灰霉病的治疗试验 除病菌先接种、Y2或DJB5后接种外，其他步骤与1.3.4处理相同。

1.3.6 病情调查与统计分析 番茄灰霉病的发病百分面积依据发病面积占果实表面积百分数来计算，预防及治疗的效果经反正弦转换后，采用SPSS 18.0软件进行方差分析，并采用新复极差法(Duncan)比较各处理和对照差异显著性，以不同字母表示处理间的差异显著性水平。预防及治疗的防治效果计算如式(1)。

2 结果与分析

2.1 疑似病原菌对番茄果实致病性测定

从番茄上分离到疑似病原菌菌株FQ-2。根据柯赫氏法则，回接到健康的番茄果实上，结果无论是以菌丝块或孢子悬浮液为接种体，均能引起番茄果实与先前病情症状相同。接种后3天接种点长出灰白色的菌丝，5天后形成圆形或近圆形的病斑，7天后菌丝颜色变为深灰色，并开始产孢。从接种发病的番茄果实上再次分离病原菌，获得的菌株与接种菌株形态完全一致（图1）。

图1 接种病原真菌后番茄果实的发病症状

2.2 病原真菌及孢子的形态

在AX10型光学显微镜(ZESS)下观察，病原菌的分生孢子梗为淡褐色，呈不规则的树状分支。分生孢子梗末端膨大，着生大量分生孢子。分生孢子为单胞，呈亚球形或卵圆形，大小为(7.04～16.69)μm×(5.73～11.43)μm，其形态特征疑似葡萄孢属真菌(Botrytissp.)。

2.3 病原真菌的分子鉴定

依据真菌的rDNA-ITS通用引物扩增序列，并在GenBank上搜索同源性片段，再聚类分析，菌株FQ-2的rDNA-ITS序列与编号Botrytiscinereaisolate YT-cp(MF 997491.1)菌株聚为同一支（图2），相似度高达99%。依据FQ-2的形态和分子特点，将从番茄果实上分离到的病原菌FQ-2定名为灰葡萄孢菌(Botrytis cinerea)。

图2 基于rDNA-ITS序列的菌株FQ-2发育进化树

2.4 Y2和DJB5发酵液对番茄灰霉病的预防效果

在接种后第10天进行调查，未接种灰霉病菌完全空白对照的番茄未发病。未接种Y2和DJB5菌株但接种灰霉病菌的对照全部发病，发病百分面积达73.50%。随着Y2和DJB5菌株处理后时间的推移，再接种灰霉病菌，病情越来越重。在当天Y2以1×106、1×107和1×108cfu/mL 3个浓度浸泡番茄果实后再接种灰霉病菌的预防效果明显，发病百分面积分别为24.00%、8.75%和23.00%（表1，图3），即预防效果分别为67.35%、88.10%和68.71%。但随着接种Y2后时间的推移，Y2的预防效果逐渐下降，如以1×107cfu/mL浓度的Y2在处理后1～5天的预防效果分别为47.28%、31.97%、31.63%、22.11%和17.01%。以相同浓度的DJB5浸泡番茄果实后，当天接种病原菌，DJB5对番茄灰霉病的预防效果明显，发病百分面积分别为27.50%、35.50%和19.50%（表1，图4），预防效果分别为62.59%、51.70%和73.47%，不同浓度的预防效果差异不显著。与Y2处理一样，随着接种病菌时间的推移，DJB5的防效亦逐渐降低，如1×108cfu/mL浓度处理番茄后1～5天再接种FQ-2，其预防效果分别为48.98%、30.95%、29.25%、17.01%和14.63%。

表1 Y2和DJB5菌液预防处理后番茄灰霉病百分面积 %

图3 Y2发酵液处理后接种灰霉病菌的番茄病情

图4 DJB5发酵液处理后接种灰霉病菌的番茄病情

2.5 Y2和DJB5对番茄灰霉病的治疗效果

接种后第10天进行调查，未接种灰霉病菌空白对照的番茄未发病。只接种病原菌未接种Y2和DJB5菌株的对照全部发病，发病百分面积达83.50%。灰霉病菌处理后不同时间接种Y2或DJB5，接种生防菌越晚病情越重。在接种1×102cfu/mL灰霉病菌的当天接种1×106、1×107和1×108cfu/mL的Y2，治疗效果明显，发病百分面积分别为31.75%、40.50%和26.25%（表2，图5），即治疗效果分别为61.98%、51.50%和68.56%。但接种生防菌的时间距离接种病原菌的时间越长，其治疗效果越差，如1×108cfu/mL浓度处理后1～5天，其治疗效果分别为65.57%、63.47%、46.11%、32.34%和9.52%。与Y2类似，接种病原菌后当天用3种浓度的DJB5处理的番茄发病百分面积分别为20.00%、17.75%和31.00%（表2，图6），即治疗效果分别为76.05%、78.74%和62.87%。接种灰霉病菌后1～5天，逐日用1×107cfu/mL DJB5处理的防效随接种时间后移逐渐降低，治疗效果分别为55.09%、54.49%、53.89%、40.12%和26.35%。

表2 Y2和DJB5菌液治疗后番茄灰霉病百分面积 %

图5 灰霉病菌处理后接种Y2发酵液的番茄病情

图6 灰霉病菌处理后接种DJB5发酵液的番茄病情

3 结论与讨论

番茄产后病害常导致严重的经济损失。笔者调查了一家公司大棚生产的水果番茄灰霉病发生情况，田间看不到任何症状，但当果实进入冷链运输和中间转港贮藏时，灰霉病发生率高达40%以上，个别批次基本失去商品价值。由于鲜果不宜采用化学农药防控，灰霉病几近放任蔓延。为保证食品的安全性，生物防治成为果蔬采后病害防治的重要途径。通过大量的研究发现，用于防治番茄灰霉病的生物防治方法主要有拮抗微生物、植物天然提取物[20-21]和植物精油[22-23]。在拮抗微生物中芽孢杆菌属因产生抗逆性强的芽孢和抗菌物质，并具有繁殖速度快等优点，成为筛选果蔬采后病害拮抗菌的重要来源。如张立新等[24]研究表明，芽孢杆菌TY-6能有效防治樱桃采后灰霉病菌。王丹[25]研究表明，苏云金芽孢杆菌D-1菌悬液能有效控制油桃采后褐斑病的发生。目前，芽孢杆菌[26-27]用于防治番茄灰霉病的研究虽已有很多，但关于番茄产后灰霉病防治的研究却相对较少。笔者采用柯赫氏法则证明番茄大量腐烂是由灰霉病菌侵染所引起的，并利用2株内生菌（Y2和DJB5）有效地控制了番茄产后灰霉病的发生，这与解淀粉芽孢杆菌[28]和贝莱斯芽孢杆菌[29]可用于防治番茄灰霉病的报道基本一致。Y2是来自小麦根部具有内生能力的菌株，DJB5是来自球花石斛茎部的内生菌，它们是非常安全的，特别是DJB5经系统安全性研究证明是安全的[30]，这些安全的内生菌用于鲜果和蔬菜防霉具有极其广阔的应用前景。

Y2和DJB5的预防和治疗效果均随着处理时间的后延下降。在先接种生防菌再接种灰霉病菌的情况下，接种生防菌晾干后当天接种灰霉病菌，在接种后第10天防效分别达88.10%和73.47%；而在接种生防菌后1天接种灰霉病菌，接种后第10天的防效相比当天接种明显下降，防效分别为47.28%和48.98%。在先接种灰霉病菌再接种生防菌的情况下，接种灰霉病菌晾干后当天以Y2和DJB5处理，第10天的治疗效果达68.56%和78.74%；在接种后1天以Y2和DJB5处理，第10天的治疗效果下降至65.57%和55.09%。尽管从防治效果看，都未达到理想的效果，但本研究是采用刺伤果皮和高剂量灰霉病菌孢子(1×102cfu/mL)浸泡果实的条件下取得的，在第10天调查时，空白对照果实发病百分面积达73.50%（预防试验）和83.50%（治疗试验），病情严重。笔者后来于采收后，直接以Y2和DJB5淋洗番茄果实，晾干后在整个冷藏过程中基本无灰霉病发生，表明这2株内生菌具有实际应用价值。然而，Y2和DJB5对其他作物产后灰霉病及其他病害是否有同样的防控效果，还有待进一步试验验证。