低共熔溶剂提取黄芩苷及其复合保鲜液在鲜肉中的应用

魏夏夏，张晓虎，郑 妍

（商洛学院生物医药与食品工程学院/陕西秦岭特色生物资源产业技术研究院，陕西商洛 726000）

0 引言

随着社会经济的高速发展，人们对食品质量安全要求越来越高，从开始追求“民以食为天”发展到“食以安为先”。食品添加剂被誉为“食品工业的灵魂”，在现代食品加工过程中功不可没。天然食品防腐保鲜剂对人体无毒害作用，可以有效地防止微生物污染，避免食物腐败变质，从而减少食物的浪费，开发天然食品保鲜剂已成为食品科学领域研究的热点之一[1-3]。商洛因药用植物资源丰富而被誉为“秦岭药库”，但当地企业却未能将所收获的药材进行全面深加工，现有相关产品较为单一，且对其利用率普遍较低。张晓虎等[4]采用超声辅助乙醇提取商洛黄芩中汉黄芩素，在最优提取条件下汉黄芩素提取率为0.526%。

研究表明，黄芩富含多种对人体健康有益的活性成分，具有抗炎[5]、抗病毒[6-8]、抗癌[9]等作用。其主要活性成分黄芩苷具有一定的生物活性，能够抑制各种导致食品腐败的微生物。刘昊等[10]研究表明7 mg/mL的黄芩苷能够增加大肠杆菌细胞膜的通透性，使内容物溢出导致细胞失活，从而达到抑制大肠杆菌的作用。目前，黄芩苷的提取主要包括水提法[11]、微波法[12]、超声法[13]、CO2-超临界流体萃取法[14]，对比发现微波提取是一种高效、绿色、提取率高的提取方法。目前采用DESs作为溶剂提取天然活性成分已经受到越来越多国内外学者的关注[15-17]。

鉴于以上叙述，本研究采用微波辅助低共熔溶剂提取黄芩中的有效抑菌成分黄芩苷，复配壳聚糖、柠檬酸制成复合保鲜液并应用于鲜肉保鲜。基于DESs作为提取溶剂的优点与微波技术的优势，以DESs作为提取溶剂辅助微波提取黄芩苷，旨在提高黄芩中黄芩苷的提取率，从而实现商洛黄芩的充分利用；采用响应面法优化单因素实验所得的3因素3水平结果，通过分析得到黄芩苷提取的优化工艺参数，以期为黄芩苷的提取工艺提供参考依据。将黄芩苷复合保鲜液应用于鲜肉保鲜，通过测定鲜肉的理化指标评价复配保鲜剂对鲜肉品质的影响，为肉类贮藏保鲜的实际应用提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 材料 黄芩于2019年9月采挖于商洛市商州区黄芩基地；鲜肉购于商洛市商州区华润万家超市。

1.1.2 试剂 黄芩苷标准品（批号110715-201318，上海纯优生物科技有限公司，纯度＞98%）；四丁基氯化铵、四辛基溴化铵、甲基三辛基氯化铵、甲基三辛基溴化铵、癸酸；柠檬酸、壳聚糖；大肠杆菌、金黄色葡萄球菌（商洛学院微生物实验室提供）。

1.2 实验仪器

研究所用仪器列于表1。

表1 实验仪器

1.3 实验方法

1.3.1 材料预处理 黄芩根清洗后于室温风干，40℃烘箱烘干，粉碎，过40目筛，备用。

1.3.2 DESs的合成与制备

（1）DESs的合成。称取摩尔比分别为2:1、1:1、1:2的癸酸（DecA，作供氢体）与四丁基氯化铵(N4444-Cl)、四辛基溴化铵(N8888-Br)、甲基三辛基氯化铵(N8881-Cl)和甲基三辛基溴化铵(N8881-Br)（作受氢体）于圆底烧瓶中，加热至澄清，过夜后得不同性质的DESs。所合成的低共熔溶剂见表2。

表2 不同组分的低共熔溶剂

（2）标准曲线的绘制。精确称定黄芩苷标准品50 mg于100 mL量瓶，乙醇定容至刻度线，得0.5 mg/mL的黄芩苷标准液。分别吸取1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL的标准液于100 mL容量瓶中，乙醇定至刻度线，摇匀，在278 nm处测吸光度，以黄芩苷浓度作横坐标，吸光度作纵坐标，绘制标准曲线并得出回归方程，见图1。

图1 黄芩苷标准曲线

（3）微波辅助提取黄芩苷的溶剂筛选。称取0.5 g黄芩粉末于烧杯中，加入10 mLDESs溶剂，参考文献[18]实验条件，得黄芩苷粗提液，过滤后吸取1.0 mL于100 mL容量瓶中，乙醇定容，测吸光度，分别计算不同DESs提取黄芩苷的得率。

1.3.3 单因素实验 以黄芩苷的提取率为指标，考察微波功率(500、600、700、800、900 W)、反应时间(5、10、15、20、25 min)、反应温度(60、70、80、90、100℃)、液固比[10:1、15:1、20:1、25:1、30:1(mL:g)]对黄芩苷提取率的影响，以确定响应面优化的实验因素及相应水平。

1.3.4 响应面优化实验 依据1.3.3单因素优化结果，选用最佳DESs作为提取溶剂，以黄芩苷提取率为响应值，采用Box-Behnken设计三因素三水平的响应面优化实验。

1.3.5 抑菌实验 参考文献方法制备培养基[19]。挑取菌种于无菌水中，震荡，制成菌悬液。向各灭菌后的培养基注入融化后的培养基，将菌悬液倒入混合，冷却待用。将滤纸分别在不同浓度的黄芩苷溶液浸渍后，取出后放置于培养基。在37℃温度条件下培养48 h后测量无菌圈的直径。

1.3.6 复合保鲜液的配制 取不同浓度的黄芩苷与1.5%壳聚糖、1%柠檬酸进行复配，将研制的复合保鲜液用于鲜肉的防腐保鲜实验，通过测定有关理化指标，检验其保鲜效果。

取鲜肉，均匀分为5组，用无菌水清洗后分别进行5个实验处理。处理1，对照组1(CT)空白对照组；处理2，对照组2(VC-Na)0.05%抗坏血酸钠；处理3，含0.1%黄芩苷的复合保鲜液；处理4，含0.2%黄芩苷的复合保鲜液；处理5，含0.3%黄芩苷的复合保鲜液。分别在制备的不同浓度的防腐保鲜液中浸泡5 min，分别置于无菌托盘上用保鲜膜密封，在40℃、相对湿度70%的恒温培养箱中进行保藏实验。

1.3.7 测定指标 pH测定参考GB 5009.237—2016的方法；参考GB/T 5009.228—2016根据消耗盐酸的量计算挥发性盐基氮的含量；过氧化值的测定参考GB 5009.227—2016中的滴定法，计算如式(1)。

式中，V1为试样用去的Na2S2O3溶液体积，mL；V0为空白试样用去的Na2S2O3溶液体积，mL；c为Na2S2O3溶液的浓度，mol/L；m为试样的质量，g。

2 结果与分析

2.1 不同DESs对黄芩苷提取率的影响

在其他实验条件相同的条件下，比较合成的不同性质的DESs对黄芩苷提取率的影响，结果如图2所示。

图2 不同低共熔溶剂的提取效果

结果表明，DES-1对黄芩苷提取率最高，为最优提取溶剂，因此本实验最终选取DES-1为提取溶剂。推测是DESs-1能够与黄芩苷分子之间形成较强的氢键，黄芩苷能够更好地溶解在溶剂中，最终的提取率达到最高。

2.2 单因素实验结果分析

单因素实验分别考察了提取时间、提取温度、微波功率、液固比对黄芩苷提取率的影响，结果如图3所示。根据单因素实验结果，最终选取微波功率700 W，提取时间10、15、20 min，提取温度70、80、90℃，液固比15:1、20:1、25:1(mL:g)为各因素水平。

图3 单因素实验结果

2.3 响应面优化实验

2.3.1 响应面实验方案与结果 实验具体处理情况及结果如表3。

表3 响应面实验方案与结果

2.3.2 回归分析 黄芩苷提取率响应面二次模型方差分析见表4，方差分析见表5。

表4 黄芩苷提取率响应面二次模型方差分析表

表5 方差分析表

对实验数据进行多元回归拟合，得到黄芩苷提取率的回归方程，如式(2)。

式中，Y为提取率，mg/g；A为提取温度，℃；B为提取时间，min；C为液固比。

根据回归方程可知，各因素影响黄芩苷提取率由大到小表现为提取时间＞液固比＞提取温度。

由方差分析表可知模型P＜0.0001，该模型差异极显著，可以用来预测工艺参数。自变量一次项提取时间B、液固比C，交互项AB、AC，二次项A2、B2、C2均差异极显著；失拟项P=0.1073＞0.05，无失拟因素存在，因此可用该回归方程代替实验真实点对实验结果进行分析。复合相关系数R2为0.9895，变异系数为1.11%，均说明模型拟合优度较好。

2.3.3 响应面分析 图4反映了各因素影响黄芩苷提取率的交互作用。从图中可以看出，在提取温度一定时，黄芩苷提取率随着提取温度的升高，在13～18 min时达到最大，当提取时间一定时，随着提取时间的延长，在提取温度达到74～90℃时黄芩苷提取率达到最大；当提取时间一定时，随着液固比的增大，黄芩苷提取率在18～25 mL/g时黄芩苷提取率达到最大，当液固比一定时，黄芩苷提取率随着提取时间的延长在12～17 min达到最大；当提取温度一定时，液固比在(18～25):1(mL:g)时黄芩苷提取率达到最大，当液固比一定时，黄芩苷提取率随提取温度上升在76～90℃达到最大。

图4 响应面实验结果

2.3.4 验证实验结果 结合单因素实验结果，通过响应面软件分析可知，黄芩苷提取实验最终的优化工艺参数为提取时间15.63 min，提取温度83.48℃，液固比为21.07:1(mL:g)时黄芩苷有最高得率为67.175 mg/g。结合实际情况，调整工艺条件为提取时间16 min，提取温度85℃，液固比20:1(mL:g)，平行实验3次取平均值，黄芩苷提取率为66.99 mg/g，与预测结果基本一致，故该提黄芩苷的提取工艺参数可以用于实际。

2.4 抑菌实验结果

由表6分析可知，黄芩苷对这2种菌均有抑菌效果。且对金黄色葡萄球菌的抑菌效果大于大肠杆菌。随着黄芩苷浓度的降低，抑菌圈直径逐渐减小，其抑菌效果逐渐减弱。

表6 黄芩苷对大肠杆菌与金黄色葡萄球菌抑菌效果

2.5 复合保鲜液对鲜肉保鲜的影响

2.5.1 pH随贮藏时间的变化 由图5可知，在1～5天时间内，5组样品的pH均呈下降趋势。可以看到，3组复合保鲜剂处理组的pH下降速度明显低于2组对照组，表明该复合保鲜剂对鲜肉具有保鲜作用，能够延缓鲜肉的腐败作用。且经复合保鲜剂处理的3组样品中，黄芩苷浓度越大，pH下降的速率越低，说明样品对鲜肉的保鲜效果与复合保鲜剂中黄芩苷的浓度呈正相关。

图5 pH随贮藏时间的变化

2.5.2 过氧化值随贮藏时间的变化 由图6可知，在1～5天内，各组的过氧化值均呈上升趋势。2～5天复合保鲜剂处理组和VC-Na组的过氧化值下降速度明显低于空白对照组，表明该复合保鲜剂和VC-Na对鲜肉均具有保鲜作用。且经复合保鲜剂处理的3组样品中，黄芩苷浓度越大，过氧化值上升速率越低，说明样品对鲜肉保鲜效果与复合保鲜剂中黄芩苷的浓度呈正相关。

图6 过氧化值随贮藏时间的变化

2.5.3 挥发性盐基氮随贮藏时间的变化 由图7可知，在1～5天时间内，各组样品的挥发性盐基氮值均呈上升趋势。含0.20%和0.30%黄芩苷的复合保鲜剂与空白对照组对挥发性盐基氮影响差异较大，表明含高浓度黄芩苷的复合保鲜剂能够抑制蛋白质分解产生胺类和含氮物质。比较这2组挥发性盐基氮的差异可知，2组复合保鲜剂组抑制蛋白质分解效果与黄芩苷浓度呈正相关。

图7 挥发性盐基氮随贮藏时间的变化

3 讨论

3.1 溶剂筛选

本研究首次应用低共熔溶剂提取商洛黄芩中黄芩苷，与张晓虎等[20]采用乙醇提取商洛黄芩叶中黄芩苷相比提取率提高了4.33%；与Wang等[21]制备的9种疏水性季铵盐类DESs，微波辅助DESs提取黄芩中的黄芩苷，其中癸酸-四丁基氯化铵N4444-Cl（物质的量比为1:2）为最优提取溶剂实验结果一致。王慧[18]合成了9种不同性质的DESs用于山西当地黄芩中黄芩苷的提取，实验结果也表明当癸酸与四丁基氯化铵摩尔比为1:2时，黄芩苷有最高提取率。原因可能是癸酸和四丁基氯化铵与提取的黄芩苷之间能够形成稳定的氢键[22-23]。低共熔溶剂与有机溶剂相比虽可提高提取物的提取率，但在实际的规模生产中具有一定的局限性，很难达到大规模的制备，且缺乏回收再生的方法，目前常用的再生方法主要包括大孔树脂吸附、冷冻干燥、固相萃取等[24-26]，相比之下大孔树脂吸附法具有操作简单、成本低廉的优势。

3.2 微波提取

本研究采用微波辅助低共熔溶剂提取黄芩中黄芩苷，能够有效提高黄芩苷的提取率，比杨威[27]采用超声波提取黄芩中黄芩苷提取率高1%。从而使商洛黄芩得到充分利用，将为商洛地区黄芩苷提取提供技术参考。与邵红等[28]采用微波提取黄芩中的黄芩苷相比，本研究黄芩苷的提取率低2.7%，由于微波实验设备的影响，本校实验室没有专门的微波提取仪器，在实验过程中对于提取温度的控制均采用人工水浴控制，因此难免会对实验结果产生不利的影响。与韩建军等[29]采用超声-微波辅助提取黄芩中黄芩苷相比提取率降低了6.8%，由于超声-微波法是将超声和微波2种方法结合起来，既具备微波的优点，又同时具备超声的空化效应、热效应，能够有效促进黄芩苷的提取[30]。因此在后续研究条件允许的情况下，可以考虑将2种提取方法结合起来达到更优提取效果。

3.3 抑菌实验

黄芩苷提取液浓度为100mg/mL时对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌圈直径分别为10.3 mm和14.1 mm，与张晓虎等[31]提取黄芩中的汉黄芩素对比，发现在相同浓度下，黄芩苷对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌效果强于汉黄芩素。有学者将黄芩苷复配微生物制备防腐保鲜液用于食品保鲜[32]，可为后续研究提供新思路。本研究只是在实验室进行黄芩苷的提取工艺，未对黄芩苷进行分离和纯化，只是对商洛黄芩粗提液进行了简单的抑菌实验研究和鲜肉保藏实验，因此在一定程度上可能会影响黄芩苷的抑菌效果[33]，后续对黄芩苷的分离纯化的工艺有待进一步研究。

3.4 保鲜应用

近年来，开发植物源天然保鲜防腐剂用于食品保鲜已成为食品防腐剂的热点之一[34-35]。Rafaela等[2]比较了黄芩提取液与其他中药提取液对不同真菌的抑制作用，通过将黄芩提取液涂抹在纸质包装袋上，在一定条件下用于馒头的保鲜。结果显示黄芩提取液对真菌的抑制作用强于其他中药提取液，且用含黄芩提取液的包装袋包装馒头能有效延长馒头贮藏期。李霞等[36]将9种香辛料应用于豆筋的保鲜，结果显示八角、丁香及辣椒对豆筋的保鲜效果最佳，能够有效延长豆筋的贮藏期。

4 结论

实验最终选取DES-1为提取溶剂，得到黄芩苷最佳提取工艺参数，即提取时间16 min、液固比20:1(mL:g)、提取温度85℃,黄芩苷有最高得率为66.99 mg/g。黄芩苷对金黄色葡萄球菌的抑菌效果大于大肠杆菌。黄芩苷浓度为100 mg/mL时，金黄色葡萄球菌的抑菌圈直径为14.1 mm，大肠杆菌为10.3 mm。随着黄芩苷浓度的降低，其抑菌效果逐渐减弱，抑菌圈直径逐渐减小。含有黄芩苷的复合保鲜剂能够有效降低pH的下降速率以及过氧化值和挥发性盐基氮的上升速率，能够有效抑制鲜肉脂肪的氧化与蛋白质的分解，且随着含黄芩苷浓度的增大，保鲜效果提高。