海洋青霉菌IMB17-009抗菌活性次级代谢产物研究

李芳，李娇，李莎莎，郝晓萌，关艳，刘玉凤，王保国，甘茂罗

·论著·

海洋青霉菌IMB17-009抗菌活性次级代谢产物研究

李芳*，李娇*，李莎莎，郝晓萌，关艳，刘玉凤，王保国，甘茂罗

100050 北京，中国医学科学院北京协和医学院医药生物技术研究所国家新药（微生物）筛选实验室（李芳、李娇、李莎莎、郝晓萌、关艳、甘茂罗）；276800 山东日照，济宁医学院药学院（刘玉凤、王保国）

分离鉴定从红树林沉积物分离的海洋青霉菌 IMB17-009 产生的抗菌活性次级代谢产物。利用中压柱色谱、凝胶柱色谱和 HPLC 等多种色谱分离方法对菌株固体发酵产物进行分离纯化，通过紫外可见光谱、质谱和核磁共振谱对化合物进行结构鉴定，采用微量液体稀释法评价化合物对革兰氏阳性菌、阴性菌和真菌的抗菌活性。从青霉菌 IMB17-009 固体发酵产物中分离获得11 个化合物，其结构分别确定为 meleagrin（1）、glandicoline B（2）、roquefortine C（3）、2-(2-(1-吲哚-3-基)乙酰基)-L-苯基丙氨酸（4）、citreohybridonol（5）、andrastin A（6）、andrastin B（7）、macrophorin A（8）、purpurogemutantin（9）、desferricoprogen（10）和deferriferrichrome（11）。化合物1、3、8、9对枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌或弯孢霉菌、交链孢菌、镰孢菌和白念珠菌等真菌具有一定的抗菌活性，最低抑菌浓度为 8 ～ 64 μg/ml。化合物4为一新的天然产物。

海洋微生物； 青霉属； 抗菌； 抗真菌； 分离纯化

近年来，多重耐药细菌、尤其是革兰氏阴性耐药菌的不断出现和快速扩散对人类健康构成了严重的威胁[1]。然而，进入 21 世纪以来，新型抗菌药物研发速度明显减慢。研发新型、有效的抗耐药菌药物成为全世界急需解决的重要问题[2]。微生物是抗菌药物发现的最重要来源。海洋由于高盐、高压、低光照、低温等特殊生境条件，使得海洋微生物可能产生与陆地微生物结构不同的产物，如生物碱、萜类、聚酮类等，这些产物不仅结构新颖

而且活性多样，有望成为药物先导化合物的重要来源[3-5]。海洋真菌广泛分布于从深海至极地冰川的广阔海域，寄生于海底沉积物、各种海洋生物和有机物中，具有丰富的物种多样性和代谢产物结构多样性[6]。在过去几年里，越来越多的新型真菌次级代谢产物逐渐被发现。海洋真菌产物具有多样的生物活性，如抗细菌、抗真菌和抗肿瘤活性[7-9]。当前，海洋真菌隐藏的巨大次级代谢潜力尚未被充分挖掘，有待于进一步的深入研究。

在从海洋微生物筛选新活性次级代谢产物的过程中[10-13]，我们对三亚红树林采集的海洋沉积物样品开展了海洋微生物的分离工作。通过活性筛选发现，分离得到的一株青霉属真菌 IMB17-009，其发酵产物显示较强的抗菌活性。通过对该菌株次级代谢产物进行系统的分离纯化研究，从中分离鉴定了 11 个化合物，其结构分别确定为 meleagrin（1）、glandicoline B（2）、roquefortine C（3）、2-(2-(1H-吲哚-3-基)乙酰基)-l-苯基丙氨酸（4）、citreohybridonol（5）、andrastin A（6）、andrastin B（7）、macrophorin A（8）、purpurogemutantin（9）、desferricoprogen（10）和deferriferrichrome（11）。（图1），其中化合物 1、3、8、9 显示出显著的抗细菌和抗真菌活性。本文报道该菌株的次级代谢产物及其抗菌活性研究结果。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 主要仪器和试剂1H、13C-NMR 谱利用 Bruker 600 MHz 核磁共振仪测定；LC-MS 分析利用安捷伦 LC-MSD-Trap/SL1100 系列液相色谱-质谱联用仪；HPLC 制备色谱利用岛津LC-20 液相色谱仪；中压色谱利用 Flash 色谱仪；凝胶柱色谱填料 Sephadex LH-20 购自 GE Biosciences 公司；Capcell C18 MG II色谱柱（5 μm，10 mm × 250 mm）购自日本资生堂公司；YMC-Pack Ph 色谱柱（5 μm，10 mm × 250 mm）购自日本 YMC 公司；人工海盐购自天津中盐海洋生物公司。

图1 青霉菌IMB17-009 分离得到的化合物

Figure 1 The isolated compounds fromsp. IMB17-009

1.1.2 培养基

⑴菌株发酵培养基

平板培养：马铃薯葡萄糖琼脂培养基 37 g，人工海盐30 g，去离子水1 L。

种子制备：PDB 培养基（马铃薯提取物 3 g，葡萄糖 20 g，人工海盐 30 g，去离子水 1 L）。

固体发酵：大米固体培养基（糙米 70 g，蛋白胨 3 g，海盐 3 g，去离子水100 ml）。

⑵检定菌培养基：营养琼脂培养基购自北京奥博星生物技术公司；MH 培养基购自中国食品药品检定研究院。

1.1.3 菌株来源 菌株 IMB17-009 从三亚红树林（18°24'09.00''N，109°51'08.00''E）采集的海底沉积物样品中分离获得。该菌株 ITS 区域 DNA 序列（GenBank No. MW350016）与青霉属娄地青霉菌（，GenBank No. MT544459.1）、雷斯青霉菌（，GenBank No. KF018471.1）等菌株具有较高的同源性，相似度均为 99.81%。根据菌株表型及 ITS 序列分析，将菌株 IMB17-009 确定为青霉菌属菌株sp.，保存于中国医学科学院医药生物技术研究所国家新药微生物筛选实验室。

1.1.4 活性检定菌 枯草芽孢杆菌（ATCC 6633）、金黄色葡萄球菌（ATCC 29213）、大肠杆菌（ATCC 25922）、铜绿假单胞菌（ATCC 27853）、肺炎克雷伯菌（ATCC 700603）、摩氏摩根菌（ATCC 25830）、白念珠菌（ATCC 10231）购自美国模式培养物集存库（ATCC）；镰孢菌（sp. CPCC 400381）、交链孢菌（sp. CPCC 400323）、弯孢霉菌（sp. CPCC 400186）由本所中国药学微生物菌种保藏管理中心余利岩研究员课题组提供。

1.2 方法

1.2.1 菌株发酵 将菌株 IMB17-009 孢子悬液接种于 PDA 培养基平板上，置于 28 ℃培养 7 d，用无菌竹签取约 1 cm2的含菌琼脂块接种于装有 100 ml PDB 液体发酵培养基的 500 ml 三角瓶中，28 ℃，200 r/min，培养 5 d 制作种子液。将种子液按 10%（v/v）的接种量，转接于含 100 ml 固体发酵培养基的 500 ml 三角瓶中，共 30 瓶，28 ℃静置培养 30 d。

1.2.2 提取分离 收集菌株 IMB17-009 固体发酵产物，依次用乙酸乙酯（6 L × 3）和甲醇（6 L × 3）进行超声提取。将提取液分别回收溶剂后进行合并，得到提取物 40 g。将提取物进行 C18 中压柱色谱（反相 C18 柱 520 g，49 mm × 460 mm）分离，依次用 10%、30%、50%、70%、100% 甲醇溶液进行梯度洗脱，每个梯度分别洗脱 3 L，回收溶剂得到 5 个馏分（F1～ F5）。

馏分 F2（2 g）经 Sephadex LH-20 凝胶柱层析（2.3 cm × 110 cm，70% 甲醇洗脱），得到 12 个组分（F2-1～ F2-12）。组分 F2-6经 HPLC 色谱纯化（Capcell C18 MG II，20% 甲醇-1‰ 甲酸水，4 ml/min）得到化合物10（10 mg）和11（10 mg）。

馏分 F3（1.5 g）经 Sephadex LH-20 凝胶柱层析（2.3 cm × 110 cm，90% 甲醇洗脱），得到 14 个组分（F3-1～ F3-14）。组分F3-6经 HPLC 色谱纯化（Capcell C18 MG II，40% 乙腈-1‰ 甲酸水，4 ml/min），得到化合物1（25 mg）和5（14 mg）。组分 F3-7经 HPLC 色谱纯化（Capcell C18 MG II，55% 甲醇-1‰ 甲酸水，4 ml/min），得到化合物2（3 mg）。组分 F3-8经 HPLC 色谱纯化（YMC-Pack Ph，33% 甲醇-1‰ 甲酸水，4 ml/min）得到化合物4（5 mg）。

馏分 F4（5 g）经 Sephadex LH-20 凝胶柱层析（2.3 cm × 110 cm，90% 甲醇洗脱），得到 13 个组分（F4-1～ F4-13）。组分 F4-4经 C18 中压柱色谱（反相 C18 柱 40 g，30% ～ 100% 甲醇，30 min 梯度洗脱，10 ml/min）得到 12 个亚组分 F4-4-1～ F4-4-12。亚组分 F4-4-3～ F4-4-6合并，经 HPLC 纯化（Capcell C18 MG II，70% 甲醇-1‰ 甲酸水，4 ml/min）得到化合物6（5 mg）和7（4 mg）。组分 F4-6经 C18 中压柱色谱（反相 C18 柱 40 g，40% ～ 100% 甲醇，60 min 梯度洗脱，10 ml/min）得到 11 个亚组分 F4-6-1～ F4-6-11。亚组分 F4-6-6～ F4-6-8合并，经 HPLC 纯化（Capcell C18 MG II，60% 乙腈-1‰ 甲酸水，4 ml/min）得到化合物3（5 mg）、8（3 mg）和9（2 mg）。

1.2.3 化合物4的立体构型鉴定 称取化合物4约 0.4 mg，溶解于 500 μl 的 6 mol/L HCl 中，110 ℃加热水解 1 h，将反应液减压浓缩得到水解产物。将水解产物和L-苯丙氨酸标准品（1 mg）分别溶解于 120 μl 的水中，各自平均分成两部分，分别加入 100 μl的 5-氟-2,4-二硝基苯基-L-亮氨酰胺（L-FDLA）或D-FDLA 的 1% 丙酮溶液，同时加入 20 μl 1 mol/L NaHCO3溶液，40℃加热振荡 1 h。待反应液冷却至室温，依次加入 10 μl 2 mol/L HCl 和 100 μl 乙腈进行稀释，离心过滤后用 LC-MS 进行检测。检测条件为：色谱柱 Capecell C18 MG II C18 5 μm，4.6 mm × 150 mm；流速 1 ml/min；A 流动相为 1‰ 甲酸水溶液，B 流动相为乙腈；0 ～20 min，5% ～ 100% B；20 ～ 25 min，100 % B，紫外检测 230 nm 波长；柱温箱 30 ℃。L-苯丙氨酸标准品L、D-FDLA 衍生物（460）的保留时间分别为 14.7 和 16.0 min。化合物4的L、D-FDLA衍生物保留时间分别为 14.7 和 15.9 min。因此，化合物4结构中苯丙氨酸单元构型确定为L型。

1.2.4 化合物活性测定

1.2.4.1 抗细菌活性测定 化合物抗菌活性最低抑菌浓度（MIC）采用微量二倍稀释法测定[10, 14]。称取待测化合物1 ～ 11及阳性对照药利福平，溶解于 DMSO 中，配制浓度为 12.8 mg/ml 的样品溶液。将各检定菌株在营养琼脂平板上进行复苏，挑取单菌落接种到 MH 培养基，于 37 ℃、200 r/min振荡培养；待菌液600为 1.0 时，再次按 1%（v/v）转接至 MH 培养基继续培养，待600为 1.0 时，取 200 μl 菌液用 MH 培养基稀释 3000 倍（菌浓度约为 5 × 105CFU/ml）备用。将上述稀释好的菌液加入 96 孔板中，第一列每孔 198 μl菌液，其余各列每孔 100 μl。在第一列孔中加入 2 μl 样品溶液，随后进行二倍稀释，分别得到以下 12 个浓度梯度：128、64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25、0.125 和 0.0625 μg/ml。每个样品重复 3 个复孔。随后将 96 孔板放入 37 ℃培养箱中培养 12 h，观测细菌情况。最低抑菌浓度（MIC）定义为没有肉眼可见的细菌生长所对应的化合物浓度。

1.2.4.2 抗真菌活性测定 将各检定菌株在 PDA 平板上复苏 5 d，挑取单菌落接种于 PDB 培养基中，于 37 ℃，200 r/min 振荡培养；待菌液600为 0.1 时，取出 100 μl 菌液用 PDB 培养基稀释 50 倍（菌浓度约为 3 × 106CFU/ml）。将上述稀释菌液加入 96 孔板中，采用微量二倍稀释法测得化合物的最低抑菌浓度[15]，样品浓度范围为 0.03 ～64 μg/ml，以制霉菌素作为阳性对照药。

2 结果

2.1 化合物结构确定

化合物1：淡黄色粉末；UV（MeOH，HPLC）λmax230，350 nm；1H-NMR（CD3OD，600 MHz）7.61（dd，= 7.8，1.2 Hz，H-4），7.07（td，= 7.8，1.2 Hz，H-5），7.27（td，= 7.8，1.2 Hz，H-6），7.02（dd，= 7.8，1.2 Hz，H-7），5.39（s，H-8），8.29（s，H-15），7.90（s，H-18），7.42（brs，H-20），6.08（brs，H-22），5.06（d，= 17.4 Hz，H-23a），5.01（d，= 9.6 Hz，H-23b），1.29（s，H-24），1.32（s，H-25），3.75（s，1-OCH3）；13C-NMR（CD3OD，600 MHz）103.2（C-2），54.0（C-3），128.5（C-3a），126.0（C-4），124.5（C-5），129.4（C-6），112.9（C-7），148.1（C-7a），110.7（C-8），144.3（C-9），160.8（C-10），126.4（C-12），167.0（C-13），108.6（C-15），127.3（C-16），137.7（C-18），131.8（C-20），43.5（C-21），144.3（C-22），113.7（C-23），23.7（C-24），24.0（C-25），65.6（1-OCH3）；ESIMS434 [M+H]+。以上数据与文献报道的 meleagrin数据[16]一致。因此，化合物1的结构确定为 meleagrin。

化合物2：白色粉末；UV（MeOH，HPLC）λmax230，350 nm；1H-NMR（CD3OD，600 MHz）7.57（d，= 7.8 Hz，H-4），7.01（t，= 7.8 Hz，H-5），7.24（t，= 7.8 Hz，H-6），6.96（d，=7.8 Hz，H-7），5.36（s，H-8），8.26（s，H-15），7.84（s，H-18），7.34（s，H-20），6.10（brs，H-22），5.07（d，= 17.4，H-23a），5.00（d，= 10.2，H-23b），1.32（s，H-24），1.29（s，H-25）；13C-NMR（CD3OD，600 MHz）101.9（C-2），52.7（C-3），127.1（C-3a），124.2（C-4），122.1（C-5），127.8（C-6），111.5（C-7），148.3（C-7a），109.1（C-8），142.8（C-9），159.5（C-10），125.5（C-12），165.8（C-13），106.9（C-15），126.2（C-16），136.2（C-18），130.6（C-20），42.0（C-21），144.8（C-22），112.1（C-23），C-24（n.d.）29.3（C-25）；ESIMS420 [M+H]+。以上数据与文献报道的glandicoline B数据[17]一致。因此，化合物2的结构确定为 glandicoline B。

化合物3：白色粉末；UV（MeOH，HPLC）λmax206，239，323 nm；1H-NMR（CD3OD，600 MHz）5.70（s，H-5a），6.59（d，= 7.8 Hz，H-7），7.05（t，= 7.8 Hz，H-8），6.71（t，= 7.8 Hz，H-9），7.19（d，= 7.8 Hz，H-10），2.52（dd，= 12.0，6.0 Hz，Ha -11），2.43（t，= 12.0，Hb-11），4.04（m，H-11a），6.36（s，H-12），7.79（brs，H-15），7.31（brs，H-17），6.06（dd，= 16.8，10.8 Hz，H-19），5.13（dd，= 10.2，1.2，H-20a），5.10（dd，= 16.8，1.2，H-20b），1.01（s，H-21），1.14（s，H-22）；13C-NMR（CD3OD，600 MHz）168.4（C-1），121.7（C-3），160.1（C-4），79.3（C-5a），152.4（C-6a），110.1（C-7），130.0（C-8），119.5（C-9），126.1（C-10），130.2（C-10a），62.6（C-10b），38.4（C-11），59.9（C-11a），111.0（C-12），125.0（C-13），C-15（n.d.），132.8（C-17），42.1（C-18），145.2（C-19），114.8（C-20），23.4（C-21），23.0（C-22）；ESIMS390[M+H]+。以上数据与文献报道的 roquefortine C数据[18]一致。因此，化合物3的结构确定为 roquefortine C。

化合物4：白色粉末；UV（MeOH，HPLC）λmax218，280 nm，1H-NMR（DMSO-6，600 MHz）4.24（dd，= 7.2，5.4 Hz，H-2），3.04（dd，= 13.2，5.4 Hz，H-3a），2.88（dd，= 13.2，7.2 Hz，H-3b），7.09（d，= 7.8 Hz，H-5），7.13（m，H-6），7.12（m，H-7），7.13（m，H-8），7.09（d，= 7.8 Hz，H-9），7.07（s，H-2'），7.40（d，= 7.8 Hz，H-4'），6.92（dd，= 8.4，7.8 Hz，H-5'），7.05（dd，= 7.8，7.8 Hz，H-6'），7.31（d，= 8.4 Hz，H-7'），3.49（m，H-8'）；13C-NMR（DMSO-6，600MHz）173.8（C-1），54.7（C-2），37.2（C-3），138.5（C-4），129.4（C-5），127.8（C-6），125.9（C-7），127.8（C-8），129.4（C-9），123.9（C-2'），108.7（C-3'），127.2（C-3'a），118.7（C-4'），118.3（C-5'），120.9（C-6'），111.2（C-7'），136.1（C-7'a），32.8（C-8'），170.0（C-9'）；ESIMS323 [M+H]+。以上数据与文献报道的 2-(2-(1-吲哚-3-基)乙酰基)-苯基丙氨酸数据一致[19]，通过 2D NMR 数据分析也进一步确定化合物4的平面结构为 2-(2-(1-吲哚-3-基)乙酰基)-苯基丙氨酸。利用 Marfey's 方法[20-21]确定化合物4 中苯丙氨酰单元绝对构型为L 构型。因此，化合物4 的结构确定为 2-(2-(1-吲哚-3-基)乙酰基)-L-苯基丙氨酸，该化合物作为天然产物是首次报道。

化合物5：白色粉末；UV（MeOH，HPLC）λmax215，278 nm；1H-NMR（CD3OD，600 MHz）2.13（ddd，= 14.4，5.4，2.4 Hz，H-1a），1.33（m，H-1b），1.72（m，H-2），4.64（dd，= 3.6，1.8 Hz，H-3），2.03（brs，H-5），4.86（m，H-6），3.24（d，= 14.4 Hz，H-7a），2.50（dd，= 14.4，4.2 Hz，H-7b），2.40（m，H-9），5.60（m，H-11），1.62（s，H-18），1.26（s，H-20），1.85（s，H-21），1.32（s，H-22），0.88（s，H-24），0.98（s，H-25），3.61（s，19-OCH3），2.03（s，CH3CO）；13C-NMR（CD3OD，600 MHz）22.1（C-1），23.0（C-2），77.5（C-3），35.4（C-4），56.3（C-5），79.6（C-6），38.2（C-7），43.3（C-8），53.1（C-9），45.1（C-10），123.3（C-11），139.1（C-12），57.3（C-13），71.2（C-14），192.4（C-15），114.8（C-16），197.0（C-17），6.3（C-18），171.9（C-19），17.7（C-20），20.4（C-21），24.4（C-22），181.6（C-23），22.7（C-24），26.5（C-25），172.0（CH3O），20.8（H3CO），52.1（19-OCH3）；ESIMS501 [M+H]+。以上数据与文献报道的citreohybridonol 数据[22]一致。因此，化合物5的结构确定为 citreohybridonol。

化合物6：淡黄色粉末；UV（MeOH，HPLC）λmax210，287 nm；1H-NMR（CD3OD，600 MHz）2.28（ddd，= 13.2，3.6，3.0 HzH-1a），0.98（ddd，= 13.2，13.2，3.6 Hz，H-1b），2.06（m，H-2a），1.59（m，H-2b），4.61（dd，= 3.0，3.0 Hz，H-3），1.84（dd，= 13.2，3.0 Hz，H-5），2.09（dd，= 13.8，4.8 Hz，H-6a），1.69（m，H-6b），3.07（ddd，= 13.2，13.2，4.2 Hz，H-7a），2.24（ddd，=13.2，3.0，

3.0 Hz，H-7b），2.15（m，H-9），5.36（s，H-11），1.58（s，H-18），1.15（s，H-20），1.75（dd，= 2.4，1.2 Hz，H-21），1.23（s，H-22），10.17（s，H-23），0.87（s，H-24），0.94（s，H-25），3.57（s，19-OCH3），2.04（s，CH3CO）；13C-NMR（CD3OD，600 MHz）28.9（C-1），24.4（C-2），79.1（C-3），38.0（C-4），49.5（C-5），17.9（C-6），33.5（C-7），42.9（C-8），54.8（C-9），53.5（C-10），123.1（C-11），137.8（C-12），57.6（C-13），69.1（C-14），190.6（C-15），113.3（C-16），201.2（C-17），6.6（C-18），172.3（C-19），16.1（C-20），20.1（C-21），19.9（C-22），207.1（C-23），21.6（C-24），27.1（C-25），172.4（CH3O），21.1（H3CO），52.0（19-OCH3）；ESIMS487 [M+H]+。以上数据与文献报道的 andrastin A 数据[23]一致。因此，化合物6的结构确定为 andrastin A。

化合物7：白色粉末；UV（MeOH，HPLC）λmax215，288 nm；1H-NMR（CD3OD，600 MHz）2.10（m，H-1a），1.03（td，= 13.2，4.2 Hz，H-1b），2.26（m，H-2a），1.56（m，H-2b），4.67（t，=3.0 Hz，H-3），1.53（m，H-5），2.10（m，H-6a），1.50（m，H-6b），2.88（m，H-7a），2.12（m，H-7b），1.93（m，H-9），5.67（s，H-11），1.58（s，H-18），1.17（s，H-20），1.76（m，H-21），1.33（s，H-22），3.92（d，= 12.0 Hz，H-23a），3.78（d，= 12.0 Hz，H-23b），0.89（s，H-24），0.99（s，H-25），3.55（s，19-OCH3），2.04（s，CH3CO）；13C-NMR（CD3OD，600 MHz）30.2（C-1），25.6（C-2），80.0（C-3），37.4（C-4），50.4（C-5），18.4（C-6），34.2（C-7），42.9（C-8），55.0（C-9），43.2（C-10），126.7（C-11），134.8（C-12），58.0（C-13），69.2（C-14），C-15（186.2），113.6（C-16），C-17（n.d.），6.5（C-18），172.4（C-19），16.1（C-20），20.0（C-21），18.1（C-22），62.6（C-23），21.5（C-24），28.4（C-25），172.7（CH3O），21.2（H3CO），51.9（19-OCH3）；ESIMS489 [M+H]+。以上数据与文献报道的 andrastin B数据[23]一致。因此，化合物7的结构确定为 andrastin B。

化合物8：白色粉末；UV（MeOH，HPLC）λmax202，236 nm；1H-NMR（CD3OD，600 MHz）1.76（m，H-1a），1.22（td，= 13.2，4.2 Hz，H-1b），1.62（qt，= 13.8，3.6 Hz，H-2a），1.51（qt，= 13.8，3.6 Hz H-2b），1.41（brd，= 13.2 Hz，H-3a），1.25（td，= 13.2，4.2 Hz，H-3b），1.16（dd，= 13.8，3.6 Hz，H-5），1.76（m，H-6a），1.32（dd，= 12.6，4.2 Hz，H-6b），2.36（m，H-7a），1.95（td，= 13.2，5.4 Hz，H-7b），1.76（m，H-9），2.36（m，H-11a），1.85（dd，= 14.4，10.8 Hz，H-11b），4.80（m，H-12a），4.60（m，H-12b），0.73（s，H-13），0.83（s，H-14），0.88（s，H-15），5.94（d，= 1.8 Hz，H-2'），4.59（s，H-4'），3.70（d，= 3.0 Hz，H-5'），4.30（d，= 18.0 Hz，H-7'a），4.26（d，= 18.0 Hz，H-7'b）；13C-NMR（CD3OD，600 MHz）40.0（C-1），20.4（C-2），43.3（C-3），34.5（C-4），56.9（C-5），25.7（C-6），39.3（C-7），150.6（C-8），52.9（C-9），40.7（C-10），22.1（C-11），107.4（C-12），34.1（C-13），22.1（C-14），15.0（C-15），195.5（C-1′），120.3（C-2'），161.2（C-3'），66.2（C-4'），62.3（C-5'），61.3（C-6'），62.2（C-7'）；ESIMS361 [M+H]+。以上数据与文献报道的 macrophorin A数据[24]一致。因此，化合物8的结构确定为 macrophorin A。

化合物9：白色粉末；UV（MeOH，HPLC）λmax202，240 nm；1H-NMR（CD3OD，600 MHz）1.78（m，H-1a），1.22（m，H-1b），1.62（m，2a），1.51（m，H-2b），1.40（m，H-3a），1.23（m，H-3b），1.18（td，= 13.2，3.6 Hz，H-5），1.78（m，H-6a），1.31（m，H-6b），2.44（m，H-7a），2.12（td，= 13.8，5.4 Hz，H-7b），2.02（m，H-9），2.22（d，=15.6 Hz，H-11a），2.02（m，H-11b），4.90（s，H-12a），4.59（s，H-12b），0.89（s，H-13），0.83（s，H-14），0.76（s，H-15），6.15（s，H-2'），3.85（s，H-5'），4.41（dd，= 18.0，1.8 Hz，H-7'a），4.34（dd，= 18.0，1.8 Hz，H-7'b），3.09（d，= 17.4 Hz，H-8'a），2.87（d，= 17.4 Hz，H-8′b）；13C-NMR（CD3OD，600 MHz）39.9（C-1），20.3（C-2），43.3（C-3），34.6（C-4），57.0（C-5），25.7（C-6），39.4（C-7），150.3（C-8），51.2（C-9），41.4（C-10），23.2（C-11），108.3（C-12），34.0（C-13），22.1（C-14），15.3（C-15），193.5（C-1'），120.8（C-2'），165.5（C-3'），71.8（C-4'），75.3（C-5'），86.5（C-6'），60.9（C-7'），43.5（C-8'），169.9（C-9'）；ESIMS419 [M+H]+。以上数据与文献报道的 purpurogemutantin 数据[24]一致。因此，化合物9 的结构确定为 purpurogemutantin。

化合物10：白色粉末；UV（MeOH，HPLC）λmax220 nm；1H-NMR（DMSO-6，600 MHz）3.81（m，H-2，2'），8.13（s，2N-H，2'N-H），1.68（m，H-3，3'），1.60（m，H-3，3'，4，4'），3.49（m，H-5，5'），9.74（s，5N-OH，5'N-OH），6.22（s，H-7，7'），2.02（8-CH3），2.39（t，= 6.6 Hz，H-9），4.17（m，H-10，12），8.27（d，= 7.2 Hz，12N-H），1.54 ～ 1.66（m，H-13，14），3.49（m，H-15），9.74（s，15N-OH），6.22（s，H-17），2.02（18，8'-CH3），2.23（t，= 6.6 Hz，H-19，9'），3.53（t，= 7.8 Hz，H-20，10'），4.56（s，20-OH，10'-OH），1.84（s，CH3CO）；13C-NMR（DMSO-6，600 MHz）167.9（C-1，1'），53.9（C-2，2'），30.4（C-3，3'），22.2（C-4，4'），46.8（C-5，5'），166.6（C-6，6'），117.2（C-7），148.7（C-8），18.1（8-CH3），40.1（C-9），62.4（C-10），172.2（C-11），52.0（C-12），28.1（C-13），23.1（C-14），46.4（C-15），166.3（C-16），116.2（C-17，7'），151.0（C-18，8'），43.9（C-19，9'），59.2（C-20，10'），169.7（CH3O），22.2（H3CO），18.3（18，8'-CH3）；ESIMS769 [M+H]+。以上数据与文献报道的 desferricoprogen 数据[25]一致。因此确定化合物10的结构为 desferricoprogen。

化合物11：黄色粉末；UV（MeOH，HPLC）λmax218 nm；H-NMR（CD3OD，600 MHz）4.43（dd，= 9.6，4.2 Hz 1H），4.33（dd，= 9.6，4.2 Hz，1H），4.22（dd，= 7.2，4.2 Hz，1H），4.17（d，= 16.2 Hz，1H），4.03（d，= 16.2 Hz，1H），4.01（d，= 16.2 Hz，1H），3.79（d，= 16.2 Hz，1H），3.76（d，= 16.2 Hz，1H），3.73（1H，=16.2 Hz，1H），3.68（m，3H），3.62（m，3H），2.10（m，9H），2.02（m，1H），1.65-1.92（m，11H）；13C-NMR（CD3OD，600MHz）174.6，174.6，174.5，173.8（2C），173.7，172.7，172.1，172.1，55.6，55.4，54.6，48.4（3C），44.3，44.0，43.6，30.3，29.9，28.8，24.6，24.3，24.2，20.4，20.3；ESIMS688.2 [M+H]+。以上数据与文献报道的 deferriferrichrome 数据[26]一致。因此，化合物11的结构确定为 deferriferrichrome。

2.2 抗菌活性

应用微量二倍稀释法对化合物1～ 11的抗菌活性进行评价，包括革兰氏阳性金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌，革兰氏阴性大肠杆菌、铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯菌和摩氏摩根菌等细菌以及白念珠菌、弯孢霉菌、交链孢菌、镰孢菌等真菌。结果显示（表 1），化合物1、3和9对金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌等革兰氏阳性菌具有一定的抗菌活性，MIC 为 32 ～ 64 μg/ml。化合物8对枯草芽孢杆菌等细菌的抑制作用较弱，但对白念珠菌以及植物内生真菌弯孢霉菌、交链孢菌和镰孢菌等真菌显示出较强的抑制活性，MIC 为 8 ～ 64 μg/ml。此外，化合物3和9对白念珠菌也具有一定的抑制活性，MIC 分别为 64、16 μg/ml。其余化合物对所有菌株均没有抑制活性（MIC > 64 μg/ml）。

表 1 青霉菌 IMB17-009 分离化合物抗菌活性（μg/ml）

注：nt：没有测定。

Note: nt: not test.

3 讨论

本研究从红树林来源青霉菌 IMB17-009 固体发酵产物分离得到 11 个化合物，化合物4为一新的天然二肽产物。从中分离的两个吲哚生物碱 meleagrin（1）和 roquefortine C（3）以及两个混源倍半萜类化合物 macrophorin A（8）和 purpurogemutantin（9）均显示出一定的抗革兰氏阳性菌和抗真菌活性，其中化合物9的抗菌活性为本文首次报道。化合物2为 meleagrin 的 1 位N-羟基衍生物，尽管有文献报道该化合物具有一定的抗菌活性[17]，但在本研究中未显示出显著的抗细菌和真菌活性（MIC > 128 或 64mg/ml），提示1 位 N-甲氧基脱甲基化会导致活性降低。文献报道 meleagrin 能够抑制烯酰酰基载体蛋白还原酶（FabI），影响细菌脂肪酸合成，除作用于 FabI 外，其抗菌活性可能还与其他靶点有关[16]。本研究结果表明，海洋来源真菌能够产生化学结构多样性的抗菌活性产物，在新型抗菌药物先导物发现中具有巨大的潜力。

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Antimicrobial secondary metabolites from the marine-derivedsp. IMB17-009

LI Fang, LI Jiao, LI Sha-sha, HAO Xiao-meng, GUAN Yan, LIU Yu-feng, WANG Bao-guo, GAN Mao-luo

Author Affiliations:Institute of Medicinal Biotechnology, Chinese Academy of Medical Sciences & Peking Union Medical College, Beijing 100050, China (LI Fang, LI Jiao, LI Sha-sha, HAO Xiao-meng, GUAN Yan, GAN Mao-luo); School of Pharmacy, Jining Medical College, Shandong 276800, China (LIU Yu-feng, WANG Bao-guo)

To identify the antimicrobial secondary metabolites from the marine-derivedsp. IMB17-009 isolated from the mangrove sediments collected at Sanya.The extracts from the solid rice fermentation cultures were isolated and purified by a combination of C18 reversed-phase flash chromatography, gel column chromatography and HPLC. Their structures were determined by spectroscopic analyses. Antimicrobial assays were performed by using the micro-broth dilution assay.11 compounds were isolated from the solid fermentation extracts ofspIMB17-009. Their structures were identified as meleagrin (1), glandicoline B (2), roquefortine C (3), 2-(2-(1-indol-3-yl)acetyl)-L-phenylalanine (4), citreohybridonol (5), andrastin A (6), andrastin B (7), macrophorin A (8), purpurogemutantin (9), desferricoprogen (10), and deferriferrichrome (11).Compound 1, 3, 8, and 9 shows antimicrobial activity against Gram-positive bacteriaandor the fungisp.,sp.,sp., andwith MIC values ranging from 8 - 64 μg/ml. Compound 4 is identified as a new natural product.

marine-derived microorganism;sp.; antibacterial; antifungal; isolation and purification

s:GAN Mao-luo, Email: ganml@imb.pumc.edu.cn; WANG Bao-guo, Email: bjr20081001@163.com

10.3969/j.issn.1673-713X.2021.03.001

国家自然科学基金（81872781）；“重大新药创制”国家科技重大专项（2018ZX09711001-007-002）；中国医学科学院医学与健康科技创新工程（2016-I2M-2-002）；济宁医学院青年教师科研扶持基金（JY 2016KJ003Z）

甘茂罗，Email：ganml@imb.pumc.edu.cn；王保国，Email：bjr20081001@163.com

2020-12-21

*同为第一作者