丹参饮预处理保护缺血/再灌注损伤模型大鼠心肌细胞实验研究

任耀龙，杨 磊，赵明君，郑 刚，徐佳萌，尤金枝，李莹超

(1.陕西中医药大学附属医院，陕西 咸阳 712021；2.陕西中医药大学，陕西 咸阳 712046)

急性心肌梗死是常见的严重威胁人类生命安全的心血管系统急危重症,临床治疗的首要目的在于尽快开通阻塞血管,恢复心肌血流灌注。然而，伴随而来的心肌缺血/再灌注损伤(Myocardial ischemia-reperfusion injury，MIRI)严重制约了临床获益[1]。目前，认为MIRI与氧化应激[2]、细胞内钙超载[3]、生理pH值快速恢复[4]、心肌能量代谢障碍[5]、炎症反应[6]等有关，但其具体病理生理机制尚未明确，且西医学应对手段较为有限。丹参饮由丹参、檀香、砂仁组成，具有活血祛瘀、行气止痛等临床功效，广泛应用于急性心肌梗死的临床治疗，并显示出一定的临床疗效。本研究以丹参饮预处理干预大鼠MIRI模型在体心肌细胞，探索中医经典名方丹参饮对大鼠心肌的保护作用及其可能的作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 研究动物：选择SPF级健康成年SD大鼠50只，雄性25只，雌性25只，质量180～210 g，购于成都达硕实验动物有限公司，许可证号[SCXK(川)2015-030]。实验动物饲养于陕西中医药大学协同创新中心SPF级动物实验中心，给予标准饲料及饮用水喂养7 d后用于实验。

1.1.2 主要试剂与仪器：肌酸激酶同工酶(Creatine kinase-MB，CK-MB)和N-末端脑钠肽前体(N-terminal probrain natriuretic peptide，NT-proBNP)试剂盒(批号20191231)，乳酸脱氢酶(Lactate dehydrogenase， LDH)试剂盒(批号20191228)。八通道研究型高速记录系统(澳大利亚埃德公司，型号PL3508/P)、SC-5型小动物呼吸机、全自动酶标仪(美国Bio-Tek公司，型号ELXSOSIU)、高速冷冻离心机(日本日立公司，型号CR22GⅡ)、Leica VT1000 S振动切片机、TC-120S生物组织自动脱水机、TR-180生物组织自动染色、倒置荧光数码显微镜[Nikon公司，型号TS100-F(配DS-5MC)IX73-U]。

1.2 实验方法

1.2.1 丹参饮：丹参、檀香各15 g，砂仁10 g，实验药物均购于陕西中医药大学附属医院中草药房。药物制备：精确称取生药40 g，加12倍自来水，浸泡30 min，按药物质量/水量=1/8量加水煎煮2次(檀香后下)，药液以1000 r/min，离心10 min除杂质，浓缩为含生药浓度1 g/ml，4 ℃下密封冷藏备用。

1.2.2 建模、分组及给药：将实验动物随机分为五组：假手术组、模型组、丹参饮低剂量组、丹参饮中剂量组、丹参饮高剂量组，每组10只，每组雌雄各5只。参考实验动物模型制备文献[7]并进行改进，具体操作方法如下。大鼠实验前12 h禁食、不禁水，以10%水合氯醛3.5 ml/kg剂量腹腔注射、实施麻醉后仰位固定于动物解剖台，正确连接Medlab信号采集系统，监测Ⅱ导联心电图，气管切开行气管插管接小动物呼吸机(潮气量2.5 ml，呼吸频率70次/min，呼吸比1∶2)，观察稳定5 min后于胸骨左缘约0.5 cm处进行开胸，剪断第4肋，刺破胸膜充分暴露心脏，剪开心包后将心脏挤出胸腔，于左心耳与肺动脉圆锥交界处高位以0号手术线缝针穿过左前降支(Left anterior descending，LAD)，同时将直径1 mm的聚乙烯管置于手术线与LAD之间，拉紧手术线使聚乙烯管压迫LAD造成急性心肌缺血模型，观察心电图以ST段抬高大于0.1 mV为结扎成功标志。缺血45 min后去除聚乙烯管恢复LAD灌注，以心脏表面颜色转红，抬高的ST段下降1/2以上为再灌注成功标志，再灌注180 min后腹主动脉取血，并快速摘取心脏用于心肌组织样本检测。假手术组手术过程与模型组相同，但只穿线不结扎冠脉。假手术组：大鼠给予等体积生理盐水，2次/d，连续灌服14 d后手术，只穿线不结扎冠脉；模型组：开胸结扎LAD，余同假手术组；丹参饮低剂量组(5 g/kg生药量)、丹参饮中剂量组(10 g/kg生药量)、丹参饮高剂量组(15 g/kg生药量)，各组均配制成10 ml/kg的药液，2次/d，连续灌服14 d后手术。

1.2.3 心电图监测：详细记录MIRI模型大鼠各阶段心电图表现。

1.2.4 CK-MB、LDH及NT-proBNP水平检测：再灌注3 h后腹主动脉取血，血液标本3000 r/min离心,取上清分装，置于-20 ℃冰箱冷冻备用，实验全部结束后严格按照试剂盒操作要求测定LDH、CK-MB和NT-proBNP等生化指标。

1.2.5 心肌梗死面积测定：大鼠心肌梗死面积的测定参照文献[8]进行，具体操作方法如下。标本采集完成后摘取心脏，以4 ℃生理盐水充分冲洗后滤纸吸水，分离出完整的左心室后称定质量；将-20 ℃速冻处理后的左心室沿心尖至基底部切为2 mm厚度的切片，切片后置于浓度为1 %的2，3，5-氯化三苯基四氮唑(2,3,5-triphenyltetrezolium chloride，2,3,5-TTC)中避光孵育10 min，成功染色后心肌梗死区域为苍白色，具有活性的非梗死区域心肌组织呈暗红色；将梗死区与非梗死区进行分离后分别称定质量。以梗死心肌质量与左心室质量的比值代表大鼠心肌梗死范围。

1.2.6 组织病理学观察：采血后快速摘除心脏，取缺血心肌组织，置于10%甲醛中进行固定，常规脱水、石蜡包埋、切片，HE染色后作光学观察，采集图像进行分析。

2 结 果

2.1 MIRI模型大鼠各阶段心电图表现 本研究详细记录了整个实验过程中各组大鼠心电图表现。大鼠行前降支结扎后，心电图表现为ST段呈弓背向上抬高，提示造模成功；45 min后取出聚乙烯管给予前降支再灌注，出现再灌注后室性心律失常，并出现Q波；再灌注180 min后心电图表现为ST段回落，病理性Q波形成。随机抽取的1只模型大鼠心电图表现情况见图1。

A：造模成功时；B：再灌注时；C：再灌注180 min时

2.2 各组大鼠CK-MB、LDH及NT-proBNP水平比较 与假手术组比较，模型组大鼠血清CK-MB、LDH及NT-proBNP水平明显升高，组间差异有统计学意义(均P<0.01)。与模型组比较，丹参饮低剂量组、丹参饮中剂量组、丹参饮高剂量组大鼠血清CK-MB、LDH及NT-proBNP水平明显降低，差异有统计学意义(均P<0.01)，且丹参饮高剂量组降低程度最大，见表1。

表1 各组大鼠CK-MB、LDH及NT-proBNP水平比较

2.3 各组大鼠心肌梗死情况比较 与假手术组比较，模型组大鼠梗死心肌质量、梗死范围较大，差异有统计学意义(均P<0.01)。与模型组比较，丹参饮低剂量组、丹参饮中剂量组、丹参饮高剂量组大鼠梗死心肌质量、梗死范围较小，差异有统计学意义(均P<0.01)；与丹参饮低剂量组比较，丹参饮高剂量组大鼠梗死心肌质量、梗死范围较小，差异有统计学意义(均P<0.01)。见表2。

表2 各组大鼠心肌梗死情况比较

2.4 各组大鼠心肌组织病理学 对大鼠缺血区心肌进行HE染色，观察各组心肌缺血/再灌注损伤后心肌细胞形态学改变情况。模型组心肌纹理紊乱，心肌细胞正常结构明显破坏，丹参饮预处理组的病理表现明显改善，并随着丹参饮剂量增加，改善效果越明显(图2)。

图2 各组MIRI大鼠心肌组织(HE染色，×20)

3 讨 论

冠脉血运重建时代背景下的急性心肌梗死治疗以尽早开通病变血管，及时恢复冠脉血流为目标，然而血流恢复后的MIRI进一步增加心肌梗死面积，诱发恶性心律失常，降低心功能，是心血管研究领域尚未解决的科学问题之一。基础研究表明，MIRI可影响心肌超微结构，导致心肌代谢紊乱、电生理失调及心肌功能异常[9]。目前，西医学应对MIRI的主要手段包括缺血预处理和缺血后处理，均为有创操作，存在进一步破坏冠脉血管床的潜在风险，临床应用受限[10-11]。

目前，医学界对MIRI的具体生理病理机制尚不清楚，认为与细胞凋亡、心肌能量代谢障碍、内皮细胞功能障碍、氧自由基爆发、细胞内钙超载、中性粒细胞浸润等有关[12-14]。近年来，中医药广泛应用于MIRI防治领域，现代药理学证实多种中药单体及中药复方可有效减少心肌凋亡、减轻心肌细胞线粒体损伤、调控自噬过程、调节内源性一氧化氮表达、抑制炎症反应，多角度发挥心肌细胞保护作用[15-17]。袁秋贞等[18]研究结果表明，心肌片能减轻心肌缺血再灌注损伤，抑制心肌细胞凋亡，其机制可能通过激活AMPK信号通路实现。李基赫等[19]研究结果显示，中药多糖组分可降低血清及缺血再灌注心肌MDA、SOD、GSH-PX含量，增加心肌Na+K+-ATPase含量，对大鼠心肌缺血再灌注氧化应激反应有一定抑制作用，表明中药多糖组分对氧化应激反应有一定抑制。丹参饮出自《时方歌括》，由丹参、檀香、砂仁组成，具有活血祛瘀，行气止痛的功效[20]，是本科研团队临床治疗急性心肌梗死最常用的经典基础方剂之一，取得了较满意的临床疗效。

本研究采用前降支结扎方法制备大鼠MIRI模型，实验中可见典型的急性心肌梗死心电图演变过程，部分大鼠在再灌注阶段记录到典型的室性心动过速表现，充分说明造模成功。本研究结果显示，丹参饮预处理可显著减低MIRI模型大鼠心肌酶学水平，保护心功能，且高浓度丹参饮保护作用较显著。在心肌梗死范围方面，高剂量丹参饮预处理组大鼠心肌梗死范围最小，进一步表明该方剂预处理可保护心肌细胞。对实验大鼠缺血区域心肌细胞进行HE染色，从病理学角度直观说明了丹参饮预处理保护了MIRI模型大鼠心肌细胞的价值。

综上所述，丹参饮预处理可明显降低MIRI模型大鼠CK-MB、LDH及NT-proBNP水平，缩小梗死面积，具有显著的心肌细胞保护作用，且存在一定的量效关系，为临床防治MIRI提供了新的思路，但其具体作用机制有待进一步研究。