柴胡皂苷D对慢性应激诱导小鼠焦虑症的影响

陈燕伟，马善波，权 伟，张 蕊

(1.空军军医大学西京医院，陕西 西安 710032；2.西安市精神卫生中心，陕西 西安 710199)

焦虑症的临床症状为持续性精神应激或阵发性惊恐,常伴有自主神经功能障碍[1]。焦虑症是一种慢性精神疾病，患病率高，给社会带来了沉重的负担[2]。目前西医治疗该病以口服抗焦虑药物为主，临床效果不理想，且极易产生药物性依赖，因此越来越多的患者趋向于中医治疗[3]。中医将焦虑症归于“郁病”范畴，且临床表现与“惊病”“脏燥”“恐病”等相似，其发病与心、脾、肝、肾等脏腑功能失调紊乱有关[4]。柴胡味苦、辛，微寒，归肝、胆、肺经，是伞形科植物柴胡或狭叶柴胡的干燥根。据《神农本草经》记载，柴胡具有解表退热、升举阳气、疏肝解郁的功效。柴胡皂苷D是从中药柴胡中分离提取的有效单体成分之一，具有抗炎、免疫调节、抗病毒和抗癌活性[5-6]。但柴胡皂苷D治疗焦虑症临床鲜有报道，本文重点研究柴胡皂苷D对于慢性应激诱导焦虑模型小鼠的影响及其作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物：50只4周龄雄性ICR小鼠，体重18～22 g，购于空军军医大学动物中心，常规条件下饲养于SPF动物中心。

1.1.2 实验药物与试剂：柴胡皂苷D由国家食品药品检定研究院提供(批号110778-201912)。盐酸氟西汀购自常州思耀制药有限公司(批号WJ-100774)。肿瘤坏死因子-α(Tumor necrosis factor，TNF-α)、白细胞介素-6(Interleukin-6,IL-6)、白细胞介素-1β(Interleukin-1β,IL-1β)酶联免疫吸附测定试剂盒均购自南京科创生物科技股份有限公司。丙二醛、超氧化物歧化酶、谷胱甘肽、谷胱甘肽转移酶均购自南京建成生物有限公司。受体相互作用蛋白140(Receptor-interacting protein 140,RIP140)、磷酸化-核转录因子κB-p65(Phosphonated nuclear transcription factor κB-p65，p-NF-κB-p65)、核转录因子κB-p65(Nuclear transcription factor κB-p65，NF-κB-p65)、磷酸化NF-κB抑制蛋白α(Phosphonated inhibitor of NF-κB α，p-IκBα)、NF-κB抑制蛋白α(Inhibitor of NF-κB α，IκBα)、磷酸化NF-κB抑制蛋白激酶(Phosphonated inhibitor of kappa B kinase α，P-IKKa)、真核NF-κB抑制蛋白激酶(Inhibitor of kappa B kinase α,IKKα)、IκB激酶β(Inhibitor of kappa B kinase β,IKK-β)、磷酸化IκB激酶β(Phosphonated inhibitor kappa B kinase β,p-IKK-β)抗体均购自美国Cell Signaling Technology公司。

1.1.3 实验仪器：离心机(美国Thermo Fisher Scientific公司，型号Heraeus Fresco 17 Centrifuge)、电泳仪(北京市六一仪器厂，型号DYY-6C)、双色红外激光扫描成像系统(美国LI-COR公司，型号Odyssey CLK)、多功能酶标仪(美国Molecular Devices公司，型号Spectra Max i3x)、分析天平(瑞士Mettler Toledo公司，型号ME104E)、酶标仪[成都贝斯达仪器有限公司，型号(雷杜RT-6000)]、正置显微镜(日本尼康公司，型号Eclipse Ti2)。

1.2 实验方法

1.2.1 造模、分组及给药：采用随机数字表法将50只小鼠随机分为正常组10只、慢性应激组10只、氟西汀组(20 mg/kg)10只、柴胡皂苷D低剂量组(20 mg/kg)10只、和柴胡皂苷D高剂量组(40 mg/kg)10只。除正常组外，其余四组小鼠均连续6周暴露于慢性应激环境建立焦虑模型。慢性应激程序按经典模型文献[7]进行。在1周的适应期后，予小鼠以下应激源：禁食禁水24 h、过夜光照、笼子倾斜45°、潮湿的锯屑环境、暴露于外来物体、光暗循环的倒置、悬伸10 min、暴露于空瓶、尾部收缩1 min。所有程序都是随机组织的，以确保实验的不可预测性，应激源的频率参照既往文献标准[8]。从第4周开始，氟西汀组小鼠每天灌胃1次氟西汀，剂量为20 mg/kg；柴胡皂苷D低剂量组、柴胡皂苷D高剂量组分别给予20、40 mg/kg的柴胡皂苷D灌胃；其余两组小鼠予等量生理盐水，均连续灌胃3周。

1.2.2 蔗糖偏好测试：各组小鼠末次灌药后，禁食禁水24 h，每笼同时放置2个水瓶，2个水瓶与笼内小鼠的距离相等，一瓶装有1%蔗糖水，另一瓶装有蒸馏水，6 h后两个水瓶互换位置，分别在实验前及12 h后称重水瓶以评估最终消耗量。蔗糖偏好=蔗糖摄入量/(蔗糖摄入量+水摄入量)×100%。

1.2.3 旷场实验：将40 cm×60 cm×50 cm大小的观察笼分成12个相等的正方形。各组小鼠末次灌药后，将小鼠放在仪器的中央，同时进行摄像和计时，记录修饰次数和穿越格子次数，观察4 min后停止摄像，修饰次数指的是单位时间内小鼠的前肢向上抬举、抓痒、洗脸、舔足等动作的次数[9]。

1.2.4 强迫游泳试验：在文献[10]所述的常规方法基础上进行强迫游泳测试。各组小鼠末次灌药后，将小鼠单独放入高20 cm、直径14 cm开放的圆柱形透明容器，温度控制在(25±1)℃，容器内水位高12 cm，并强迫小鼠游泳6 min。在最后4 min内，由两名对实验不了解的独立观察者记录小鼠不动时间为强迫游泳不动时间。小鼠在水中漂浮而没有挣扎和逃跑行为的时间被定义为不动时间。

1.2.5 尾部悬挂试验：在文献[11]描述的常规方法基础上进行尾部悬挂实验。各组小鼠末次灌药后，将听觉和视觉分离的小鼠用胶带在距离尾部末端2 cm处固定，将其悬挂6 min，头部离地面约50 cm。由两名对实验不了解的独立观察者测量最后4 min内的不动时间。

1.2.6 ELISA法检测炎症细胞因子水平：各组小鼠行为学测试后，眼球采血后颈椎脱臼法处死，将血样放入离心管内，3500 r/min，离心10 min，收集血清。将标准品稀释后加样，置37 ℃孵育30 min，20 ml的30×PBS缓冲液、580 ml纯水配制成600 ml、pH值为7.4的洗液，孵育完成后撤掉封板膜，弃液后甩干，加洗涤液静置30 s后弃去，重复5次，加酶50 μl，再次温育、洗涤，加显色剂A、B显色，37 ℃避光显色15 min后加终止液50 μl，用微孔板分光光度计在450 nm读取每个孔的吸光度。计算血清中TNF-α、IL-6和IL-1β表达水平。

1.2.7 Western blot法检测RIP140/NF-κB相关蛋白表达：取100 mg海马组织，用溶解缓冲液(含蛋白酶和磷酸酶抑制剂的RIPA)冰上提取30 min，4 ℃，12000 r/min，离心5 min以去除碎片。将样品加至SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳上，并转移到聚偏二氟乙烯膜上。将膜与一抗在4 ℃下孵育过夜，用5%脱脂乳封闭，然后用TBST洗涤3次后，室温下用二抗体孵育1 h，用ECL高级试剂盒建立并固定条带。采用图像分析软件进行数据分析。

1.2.8 免疫组织化学法检测RIP140蛋白表达：用含有4%多聚甲醛溶液固定海马组织，石蜡包埋，切片，将海马石蜡切片4 ℃下加热1 h，二甲苯脱蜡，分级乙醇水合，用缓冲液洗涤载玻片，1% H2O2处理15 min，牛血清白蛋白封闭切片，予抗RIP140和p-NF-κB-p65的一级抗体4 ℃孵育过夜，缓冲液洗涤样品后，予生物素化的二级抗体和抗生物素蛋白-生物素过氧化物酶复合物孵育，苏木精复染载玻片。采用图像分析软件进行数据分析。

2 结 果

2.1 各组小鼠蔗糖偏好比较 慢性应激组小鼠蔗糖偏好明显低于正常组小鼠，差异有统计学意义(P<0.05)。柴胡皂苷D低剂量组、柴胡皂苷D高剂量组和氟西汀组小鼠蔗糖偏好均高于慢性应激组小鼠，差异有统计学意义(P<0.05)。见表1。

表1 各组小鼠蔗糖偏好比较(%)

2.2 各组小鼠穿越次数、修饰次数比较 慢性应激组小鼠穿越次数、修饰次数明显低于正常组小鼠，差异有统计学意义(均P<0.05)。柴胡皂苷D低剂量组、柴胡皂苷D高剂量组和氟西汀组小鼠穿越次数、修饰次数高于慢性应激组小鼠，差异有统计学意义(均P<0.05)。见表2。

表2 各组小鼠穿越次数和修饰次数比较(次)

2.3 各组小鼠悬尾不动时间、强迫游泳不动时间比较 慢性应激组小鼠悬尾不动时间、强迫游泳不动时间长于正常组小鼠，差异有统计学意义(均P<0.05)。柴胡皂苷D低剂量组、柴胡皂苷D高剂量组和氟西汀组小鼠悬尾不动时间、强迫游泳不动时间均短于慢性应激组小鼠，差异有统计学意义(P<0.05)。见表3。

表3 各组小鼠悬尾不动时间与强迫游泳不动时间比较(min)

2.4 各组小鼠炎症细胞因子水平比较 慢性应激组小鼠TNF-α、IL-6和IL-1β表达高于正常组小鼠，差异有统计学意义(均P<0.05)。柴胡皂苷D低剂量组、柴胡皂苷D高剂量组和氟西汀组小鼠TNF-α、IL-6和IL-1β均低于慢性应激组小鼠，差异有统计学意义(均P<0.05)。见表4。

表4 各组小鼠炎症细胞因子水平比较(pg/mg)

2.5 各组小鼠RIP140/NF-κB相关蛋白相对表达比较 由图1可知，与正常组小鼠比较，慢性应激组小鼠海马组织中RIP140、p-NF-κB-p65、p-IκBα、p-IKKα和p-IKKβ表达上调，差异有统计学意义(均P<0.05)。与慢性应激组小鼠比较，柴胡皂苷D低剂量组、柴胡皂苷D高剂量组和氟西汀组小鼠海马组织RIP140、p-NF-κB-p65、p-IκBα、p-IKKα和p-IKKβ表达下调，差异有统计学意义(均P<0.05)。

A:正常组；B:慢性应激组；C:氟西汀组；D:柴胡皂苷D低剂量组；E:柴胡皂苷D高剂量组

2.6 各组小鼠RIP140蛋白表达比较 与正常组小鼠比较，慢性应激组小鼠海马组织中RIP140蛋白表达上调；与慢性应激组小鼠比较，柴胡皂苷D低剂量组、柴胡皂苷D高剂量组小鼠海马组织中RIP140蛋白表达下调(图2)。

A:正常组；B:慢性应激组；C:氟西汀组；D:柴胡皂苷D低剂量组；E:柴胡皂苷D高剂量组

3 讨 论

中医将焦虑症归属于“郁病”范畴，并与“惊悸”“奔豚”“怔忡”等存在一定联系[12]。焦虑症属于中医情志疾病，与肝、心、肾、胆、脾等脏腑关系密切，以肝失疏泄、肝郁气滞、心脾失养、阴阳气血失调为主要病机。柴胡具有疏肝理气、解郁活血的功效，临床常用于肝郁气滞证，代表方剂为柴胡疏肝散[13]。分析中药复方治疗焦虑症的用药规律，中药柴胡出现频次位列第四[14]。研究表明柴胡加龙骨牡蛎汤可改善广泛性焦虑症患者症状[15]，并发现其作用机制与柴胡加龙骨牡蛎汤可以改善旷野实验、迷宫实验评分，抑制核因子κB(Nuclear factor kappa-B，NF-κB)信号介导的炎症反应，减少炎症因子释放有关[16]。

现代医学研究表明，神经炎症在焦虑症中起着重要作用[17]。TNF-α、IL-6和IL-1β等促炎细胞因子在情绪行为和神经内分泌的调节中起重要作用，且有研究证实，IL-1β参与神经内分泌系统的调节，因此检测小鼠海马组织促炎细胞因子浓度。本实验结果表明，慢性应激组小鼠体内TNF-α、IL-6和IL-1β表达水平均有不同程度的升高，柴胡皂苷D低剂量组、柴胡皂苷D高剂量组、氟西汀组均降低了慢性应激诱导焦虑模型小鼠TNF-α、IL-6和IL-1β表达水平。

RIP140蛋白是介导炎症级联反应的主要因素。RIP140蛋白可激活促炎细胞因子生成，调节巨噬细胞炎症进程，进一步与NF-κB或环磷酸腺苷反应元件结合蛋白相互作用。此外，NF-κB抑制蛋白的磷酸化触发NF-κB的激活，促进促炎基因的转录和炎症细胞因子表达[18]。本研究结果显示，柴胡皂苷D低剂量组、柴胡皂苷D高剂量组、氟西汀组均降低慢性应激诱导焦虑模型小鼠海马组织中RIP140、p-NF-κB-p65、p-IκBα、p-IKKα、p-IKKβ蛋白表达水平。