星蒌承气汤对急性脑缺血模型大鼠行为学及CREB-BDNF通路的影响

刘 悦，于 博，许 洁，佟 阳

(辽宁中医药大学附属第二医院脑病科，辽宁 沈阳 110034)

脑血管疾病发病率近年来有逐年上升的趋势，其中约有75%的脑血管事件属于缺血性脑卒中，大多数患者遗留明显肢体、语言以及认知方面的障碍，严重影响患者重返社会[1-3]。虽然现代康复训练可在一定程度上改善患者的功能障碍，但效果仍差强人意。中医在脑血管疾病中的作用有目共睹，缺血性脑卒中属于中医“中风”“偏枯”等范畴，毒邪是风、火、痰、瘀各种因素量变到质变的结果，随着研究深入“毒损脑络”病机理论被逐渐认可，大承气汤是《伤寒论》中化痰通腑的经典方，该方被大量用于治疗缺血性脑卒中[4]，但其作用机制目前尚无统一定论，本团队利用中脑动脉栓塞(Middle cerebral artery occlusion，MCAO)模型大鼠模拟人体急性脑卒中病理，探讨星蒌承气汤的作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物：本研究选用上海斯莱克实验动物公司的实验动物为SPF级健康成年体重为200～250 g的SPF雌性大鼠45只，喂养于实验动物中心SPF级动物房。动物房处于恒温恒湿环境，恒定温度为22 ℃，湿度为50%，光照黑暗各12 h交替，动物的处置符合实验动物伦理学原则。

1.1.2 仪器及试剂：PCR反应扩增仪DNA测序列分析仪、BIO RAD凝胶成像仪、韩式穴位神经刺激仪、RM2235切片机、VE-180垂直电泳槽、PMSF、电泳胶配液、BCA蛋白定量试剂盒、超敏ECL化学发光液，β-actin、环磷酸腺苷反应元件结合蛋白(Camp-response element binding protein，CREB)抗体、脑源性神经营养因子(Brain-derived neurotrophic factor，BDNF)抗体。

1.2 实验方法

1.2.1 模型的建立：模型组及中药组大鼠参照改良的Longa等[5]线栓法进行MCAO模型的制备，具体过程如下：先将大鼠进行称重，根据每只大鼠的不同体重注射一定比例(0.3 ml/kg)10%的水合氯醛，待大鼠充分麻醉后将大鼠固定于手术台面上，充分清理大鼠颈部皮肤后做一竖型切口，随后用完钳缓慢剥离出左侧颈总动脉、颈内动脉及颈外动脉，用尼龙绳于颈总动脉、颈外动脉近心端结扎，并用动物血管夹夹闭颈内动脉，随后于颈总动脉处做一切口，将线栓缓慢插入切口并推送至颈内动脉，直至出现抵触感后停止推送。将线栓固定于颈总动脉后缝合伤口，常规消毒。空白组大鼠仅接受麻醉、剥离血管后缝合皮肤及常规消毒。

1.2.2 分组与给药：45只SPF大鼠随机分为空白组、模型组及中药组，每组各15只。空白组及模型组大鼠不进行任何干预手段，中药组大鼠在造模第2天开始接受星蒌承气汤灌胃治疗。方剂：全瓜蒌、胆南星各12 g，生大黄9 g，芒硝6 g，水煎，剂量按照按人/鼠公斤体重的等效剂量计算，1次/d，连续干预7 d。模型组及空白组予等体积生理盐水灌胃。

1.2.3 行为学变化：采用改良神经功能缺损程度评分(Modified Neurological Severity Scores,mNSS)对各组大鼠的神经行为学进行评估，该量表主要从运动、感觉、反射、平衡4个环节进行测评；总分18分，分数越高提示神经功能缺失越严重。

1.2.4 脑梗死体积：每组随机抓取3只大鼠，麻醉后脱颈处死，快速取脑后将脑组织置于-80 °C冰箱冰冻20 min，随后取出脑组织冠状面平均切成5等份，采用2,3,5-氯化三苯四唑液体对脑组织进行均匀染色，脑梗死体积区域显示苍白色，未梗死区域显示红色。随后将染色后的脑组织取出后排列于器皿内，用高清数码相机拍摄后输入计算机，采用相关图像处理系统计算脑梗死体积。

1.2.5 CREB-BDNF通路标志性蛋白水平的测定：采用免疫组化法对BDNF的蛋白表达进行测定，每组随机抓取3只大鼠，用事先配制好的多聚甲醛从大鼠的心耳处进行灌流，随后取出脑梗死组织，进行组织修剪切块，随后将修切的脑组织进行梯度脱水，将充分脱水的脑组织浸蜡包埋，随后进行切片、捞片、烘片，将组织薄片置于防脱载玻片上，进行抗原修复、染色，将按一定比例稀释后的一滴滴加到切片上随后用PBS溶液漂洗，再加入羊抗鼠/兔IgG聚合物试剂，孵育10 min后再次用PBS溶液漂洗，将DAB显色液滴入，并在显微镜下观察显色，再用中性树胶进行封片处理，随后光镜下进行读片，对阳性目标光密度进行测量。

1.2.6 CREB-BDNF mRNA水平的测定：在脑组织样品加入Buffer TBP(与脑组织按照1∶2比例加入)后混匀后静置1 min，将样本充分离心后摒弃上清液，再次加入等量Buffer TBP后置于4 ℃，2000 r/min下离心10 min取白色沉淀物。将事先混合好的Buffer digestion与Proteinase 浓液再次加入至检测样本内，充分震荡后进行水浴(56 ℃恒温)5 min，加入Buffer PR后混匀，-20 ℃下静置15 min后室温、3000 r/min条件下离心10 min，吸取上清液，将异丙醇浓液加入上清液内充分混匀，室温下静置5 min，室温、3000 r/min条件下离心10 min，摒弃上清液后加入75%乙醇，充分混匀，室温下静置5 min，室温、3000 r/min条件下离心10 min，再次摒弃上清液。室温下待乙醇充分挥发后加入TE Buffer提取DNA。严格按照聚合酶链反应条件，即变性温度、变性时间、退火温度、退火时间、延伸温度、延伸时间、循环次数、循环时间进行实验操作。GAPDH引物上游序列5’-CAACGGGAAAC-CCATCACCA-3’;下游序列5’-ACGCCAGTAGACTC-CACGACAT-3’。CREB引物上游序列5’-CAACCGGCAC-CCATCGAAC-3’;下游序列5’-ACGCCATCGAGCACTC-CACATCCT-3’。BDNF引物上游序列5’-CAACCCGAAAC-CCATCAGAA-3’;下游序列5’-ACGCCAGTCAGCACTC-CACGAGCT-3’。

1.3 统计学方法 采用统计学软件SPSS 20.0进行研究数据的分析。所得计量数据以均数±标准差来描述，组间比较采用两样本t检验或两样本秩和检验；组内比较采用配对t检验或配对秩和检验。以P<0.05为差异具有统计意义。

2 结 果

2.1 三组大鼠行为能力评分比较 造模后，模型组及中药组大鼠活动能力明显减弱；中药组在治疗后mNSS评分降低，与模型组比较差异有统计学意义(P<0.05)，见表1。

表1 三组大鼠mNSS评分比较(分)

2.2 三组大鼠脑梗死体积比较 造模后模型组及中药组大鼠出现明显脑梗死区域，中药组在治疗后脑梗死区域缩小，与模型组比较，差异有统计学意义(P<0.05)，见图1、2。

图1 三组大鼠脑片TTC染色结果

图2 两组大鼠脑梗死体积比较

2.3 三组大鼠脑组织CREB、BDNF蛋白相对表达比较 模型组及中药组大鼠脑组织CREB、BDNF蛋白相对表达水平明显下调。中药组在治疗后CREB、BDNF蛋白相对表达有所提升，明显高于模型组，组间比较差异有统计学意义(均P<0.05)。见表2(图3)。

表2 三组大鼠脑组织CREB、BDNF/内参IOD比较

图3 三组大鼠脑组织CREB、BDNF蛋白表达

2.4 三组大鼠脑组织CREB、BDNF mRNA表达比较 造模后模型组及中药组大鼠脑组织CREB、BDNF mRNA表达水平明显下调。中药组在治疗后CREB、BDNF mRNA有所提升，且高于模型组(P<0.05)，见表3(图4)。

表3 三组大鼠治疗后CREB、BDNF mRNA/内参比较

图4 三组大鼠脑组织CREB、BDNF mRNA表达

3 讨 论

缺血性脑卒中是临床脑血管疾病的主要发病类型，其中大脑中动脉的梗死最为多见。由于大鼠的脑血管解剖结构及生理病理机制与人类极为相近，且对手术的耐受较为理想，故本研究选用SD大鼠制备大脑中动脉缺血动物模型以模拟人类缺血性脑卒中。缺血性脑卒中属于中医“中风”“偏枯”等范畴，是由多种因素共同作用的复杂病理过程，其中风、火、痰、瘀是主要因素，毒邪是风、火、痰、瘀各种因素量变到质变的结果，故现代医家[6-10]提出了“毒损脑络”的病机理论。认为急性中风患者体内存在诸多内毒，包括热毒、瘀毒、戾毒，诸多内毒相互作用破坏脑络，损害脑髓，导致脑组织气血渗、透灌流异常，神机失用，经络不养，故导致半身偏枯失用。临床长期研究发现，痰热腑实证是中风初始阶段的重要证型，多数患者存在大便秘结、舌苔黄腻、脉弦滑等征象，此类征象不但是热证、痰证、腑实证的共同临床表现，亦是中风疾病在此阶段的核心病机，风痰瘀火之毒遏制脉络，气机升降失司，腑气不通，神明受扰，形体败坏。因此化痰通腑，祛邪解毒是缺血性脑卒中急性期的治疗关键点[11-12]。

大承气汤是《伤寒论》中化痰通腑的经典方，星蒌承气汤是由大承气汤化裁而来，由王永炎教授根据多年临床经验总结而来。本方由全瓜蒌、胆南星、生大黄、芒硝组合而成，方中瓜蒌性寒味苦，有清热化痰、宽胸散结之功效，同时伴有润燥滑肠的作用；胆南星性凉味苦，是清热化痰，熄风止痉之良品；大黄苦寒，有泻热毒，破积滞，行瘀血的功效。芒硝咸、苦，寒，有泻热通便，润燥软坚，清火消肿的作用。诸药合用，降胃气，以恢复其主降的功能；清化热痰浊毒，防止痰热化风，风痰上扰，窍闭神昏诸证。其泻下作用虽然猛烈，但由于方证相应，善其应用，标本相得，邪气乃伏[13-15]。本研究发现加用星蒌承气汤后大鼠的mNSS评分明显下降，说明星蒌承气汤可明显改善急性脑卒中大鼠的神经缺损症状，此外我们利用TTC染色证实模型组大鼠脑组织出现明显梗死灶，提示此研究造模成功，并发现星蒌承气汤可明显缩小大鼠的脑梗死体积，说明该方有明显的脑保护效应。

在探讨星蒌承气汤作用机制时我们对各组大鼠脑组织的CREB-BDNF信号通路标志性蛋白的表达进行检测对比。CREB-BDNF信号通路是维持中枢神经正常生理活动重要的途径，与神经的再生、分化、存活等过程关系密切。有研究显示急性脑缺血再灌注损伤模型大鼠的CREB表达受抑制，CREB在神经元缺血缺氧后的神经再生作用毋庸置疑，BDNF是CREB下游的关键因子，于80年代初由德国神经生物学家Brade首次发现并报道，研究人员证实BDNF属于与神经生长、增殖、凋亡密切相关的、广泛存在于中枢神经系统的一种蛋白质，是神经营养因子家族重要成员之一[16-17]，被认为是治疗不同神经性疾病的潜在药物。在神经生长、成熟阶段，BDNF充分参与调节合成代谢、增加神经元胞体大小、促进受损神经元修复并促进其再生。此外，BDNF浓度上调还可刺激成熟神经元轴突、树突的萌芽，并增强放大突触间的信号传递，增强突出前后长时程，介导神经元的可塑性[18]。BDNF广泛分布于大脑皮层、海马、丘脑、小脑等，其中皮层及海马的含量最为丰富。本研究中我们利用Western blot法及PCR法发现急性脑卒中大鼠脑组织BDNF蛋白及mRNA的水平明显下降，经过星蒌承气汤干预后大鼠脑组织BDNF蛋白及mRNA的水平均明显上调，说明星蒌承气汤通过上调BDNF的表达水平实现脑保护效应。