基于miR-34a/SIRT1通路研究电针刺激对脑卒中大鼠神经功能恢复的促进作用

高国强 冯亚男 崔华峰

(1济宁医学院附属滕州市中心人民医院，山东 滕州 277599；2滕州市中医医院；3山东中医药大学附属医院针灸科)

脑卒中是临床中常见的脑血管疾病，致残率与致死率高，对神经功能造成伤害，影响患者日后正常生活，有效促进脑梗死患者神经功能恢复是目前临床亟待解决的问题〔1,2〕。电针刺激是指在刺入人体穴位的毫针上，用电针机通以微量低频脉冲电流的一种治疗方法。研究显示电针刺激对神经功能的恢复有帮助〔3〕，但其机制尚未完全清楚。SIRT1是最早在酵母中发现的一种可调控寿命基因，研究显示其在神经保护中发挥重要作用〔4〕。研究发现在动物体内，miR-34a分子主要表达于脑组织，可调控SIRT1参与一系列生理病理活动〔5〕。因此本研究构建大鼠大脑动脉闭塞模型，并基于miR-34a/SIRT1通路探讨电针刺激对大鼠神经功能恢复的作用并探讨可能机制。

1 材料与方法

1.1材料 健康雄性SD大鼠50只，体重180～200 g，由湖南斯莱克景达实验动物有限公司提供，专用标准颗粒饲料、水喂养，实验动物使用许可证号：SYXK(湘)2014-0012，实验动物生产许可证号：SCXK(湘)2014-0002。大鼠均于室内通风柜中饲养，手术前1 d晚上禁食。环球牌针灸针(直径0.25 mm，长度30 mm)购自豪嘉医疗器械专营店，华佗牌SDZ-Ⅱ型针灸治疗仪购自重庆美乐医疗器械有限公司。Trizol试剂盒(12183555)、反转录酶试剂盒(12574018)、蛋白提取试剂盒(AM1556)、BCA试剂盒(23227)购自赛默飞世尔中国公司；鼠抗人SIRT1抗体(ab17193)购自美国abcam公司；GAPDH(sc-47724)购自美国Santa Cruz公司。

1.2方法

1.2.1动物分组、造模及处理 将大鼠分为正常组、模型组、假电针刺激组、假穴位电针刺激组、电针刺激组。除正常组外，均参照文献〔6〕左侧大脑中动脉线栓闭塞法制作，构建脑卒中大鼠模型。在大鼠颈外动脉分叉处结扎颈动脉，在近心端结扎颈总动脉，在颈总动脉近颈内、颈外动脉分叉处剪一小口，将尼龙线(直径0.2 mm)顺势缓慢插入大脑中动脉，栓塞大脑中动脉起始端的血流，然后以尼龙线结扎颈总动脉。造模成功标准：大鼠苏醒后右侧肢体疼痛回缩迟钝或消失；提尾倒悬时右上肢向胸前屈曲；行走时右侧倾倒或向右转圈；左侧出现霍纳征。排除标准：造模不成功；中途死亡。模型制备成功后，将假电针刺激组、假穴位电针刺激组、电针刺激组大鼠固定，待大鼠安静后，电针组于每天上午9∶00～11∶00对大鼠百会穴、大椎穴〔7〕进行电针处理，频率2 Hz，强度3 mA，时间20 min，刺激前经行皮肤消毒，干涉21 d。假电针刺激组于每天上午9∶00～11∶00行假电针干涉21 d(仅将针插入穴位，不给予电刺激)。假穴位刺激组于每天上午9∶00～11∶00将电针插入穴位右侧1 cm处，给予电刺激，同电针处理。

1.2.2平衡木行走实验评分 行电针刺激、假穴位电针刺激、电针刺激第1、3、14、21天分别测定运动整合及协调能力，平衡木长80 cm，宽2.5 cm，平放在距离地面高10 cm处，术前1 w每天早晚各训练1次,每次10 min,使其能顺利在平衡木上行走，按Feeney 5级计分〔8〕标准0分，可正常穿过平衡木；1分，穿过平衡木，但小于一半的路程中出现脚滑现象；2分，穿过平衡木，但有大于50%的路程中出现脚滑现象；3分，可穿过平衡木，但瘫痪侧后肢拖行；4分，无法穿过平衡木，但可在平衡木上保持平衡；5分，将大鼠放在平衡木上会掉下来。

1.2.3抓握牵引试验 行电针刺激、假穴位电针刺激、电针刺激第1、3、7、14、21天分别进行抓握牵引试验，将直径0.15 mm的钢丝绳置于距离地面70 cm固定，下面放厚5 cm的海绵垫以防大鼠摔伤。将大鼠两个前爪放钢丝绳上，记录大鼠悬挂时间〔9〕。0分，挂在绳上0～2 s；1分，挂在绳上3～4 s；2分，挂在绳上5 s；3分，挂在绳上超过5 s。

1.2.4神经功能缺损评分的监测 末次刺激结束后，参照文献方法评估大鼠神经功能缺损评分〔10〕：0分，无神经功能障碍；1分，右前爪无法充分外展；2分，走时向右转圈；3分，行走时向右倾倒；4分，无法自主行走，出现意识障碍。

1.2.5大鼠脑组织梗死比测量 各组大鼠末次刺激结束后，随机抽取5只，快速断头取脑，冰冻20 min后去除小脑及低位脑干，从额极至枕极做2 mm连续冠状切片，将切片置于2%的2，3，5-氧化三苯基四氮唑(TTC)染液中，37℃避光育30 min，转移至4%多聚甲醛溶液中固定，正常脑组织呈红色，梗死区呈白色，用眼科镊仔细分离白色区与红色区，参照文献〔7〕方法分别称重，计算梗死区占全脑的百分比作为梗死比〔11〕，梗死比(%)=白色区重量/(白色区重量+红色区重量)/100%。剩余各组大鼠分离脑组织，一部分经固定、脱水后石蜡包埋，连续切片4 μm，进行苏木素-伊红(HE)染色，光学显微镜下观察脑组织病理变化情况；另一部分储存于液氮中保存备用。

1.2.6实时荧光定量聚合酶链式反应(qRT-PCR)法检测血清miR-34a水平 按照Trizol试剂盒操作说明提取1.2.5液氮中脑组织标本中总RNA，通过反转录酶试剂盒Superscript Ⅲ将2 μg RNA反转录合成cDNA。采用Real Master Mix试剂盒行qRT-PCR检测miR-34a表达水平，PCR条件：95℃预热10 min、(95℃ 15 s、60℃ 30 s、72℃ 30 s)×40个循环。以U6为内参基因，采用2-ΔΔCt算法计算miR-34a相对表达量。正向引物：5′-GGGAAUAGU-AGCUGUCAAATT-3′，反向引物：5′-UUUGACAGCUACUAUUCCCTT-3′；miR-34a正向引物:5′-ACTCTACCTACATCTGGGACACT-3′，反向引物：5′-GTAGGTCCCATGGTCATCCAG-3′。试验重复3次，取平均值。

1.2.7免疫印迹法检测SIRT1蛋白表达 取1.2.5液氮中各组大鼠适量脑组织，RIPA裂解液裂解，充分裂解后4℃、12 000 r/min离心10 min，收集上清液，BCA法测定蛋白含量。取一定量蛋白质，加入上样缓冲液，95℃煮沸5 min，离心后取上清进行十二烷基硫酸钠(SDS)-聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)。电泳后，将分离的蛋白条带转膜至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜，5%脱脂牛奶37℃封闭2 h。加入SIRT1一抗(1∶1 000)，4℃孵育过夜，清洗PVDF膜后，加入二抗37℃孵育2 h，洗膜。加入电化学发光(ECL)液避光显影。Image J图像软件测定各蛋白条带的灰度值，以GAPDH为内参，目的蛋白与GAPDH条带灰度值的比值代表目的蛋白的相对表达水平。

1.3统计学方法 采用SPSS17.0软件进行方差分析、LSD-t检验。

2 结 果

2.1各组平衡木试验评分比较 正常组各时间点平衡木试验评分差异无统计学意义(P>0.05)，模型组平衡木试验评分于术后3 d达最顶峰，随后下降，假电针刺激组、假穴位电针刺激组、电针刺激组各时间点平衡木试验评分依次降低；与正常组相比，模型组各时间点平衡木试验评分均显著升高(P<0.05)；与模型组相比，假电针刺激组、假穴位电针刺激组、电针刺激组各时间点平衡木试验评分均显著下降(P<0.05)；假电针刺激组与假穴位电针刺激组各时间点平衡木试验评分差异无统计学意义(P<0.05)；与假电针刺激组、假穴位电针刺激组相比，电针刺激组各时间点平衡木试验评分均显著下降(P<0.05)。见表1。

2.2各组肌力测验评分比较 正常组各时间点肌力测验评分差异无统计学意义(P>0.05)，模型组肌力测验评分于术后3 d达最低谷，随后上升；假电针刺激组、假穴位电针刺激组、电针刺激组术后1 d、3 d、14 d、21 d肌力测验评分依次升高。与正常组相比，模型组各时间点肌力测验评分均显著降低(P<0.05)；与模型组相比，假电针刺激组、假穴位电针刺激组、电针刺激组各时间点肌力测验评分均显著升高(P<0.05)；与假电针刺激组相比，假穴位电针刺激组各时间点肌力测验评分差异无统计学意义(P<0.05)，电针刺激组各时间点肌力测验评分均显著升高(P<0.05)；与假穴位电针刺激组相比，电针刺激组各时间点肌力测验评分均显著升高(P<0.05)。见表2。

表1 各组平衡木试验评分、脑组织神经功能缺损评分及脑组织梗死比比较

表2 各组肌力测验评分及脑组织miR-34a、SIRT1蛋白表达比较

2.3各组神经功能评分 正常组无神经功能缺损。与模型组相比，假电针刺激组、假穴位电针刺激组、电针刺激组大鼠脑组织神经功能缺损评分显著降低(P<0.05)；假电针刺激组与假穴位电针刺激组大鼠脑组织神经功能缺损评分差异无统计学意义(P>0.05)；与假电针刺激组、假穴位电针刺激组相比，电针刺激组大鼠脑组织神经功能缺损评分显著下降(P<0.05)。见表1。

2.4各组脑组织梗死比比较 正常组脑组织无梗死。与模型组相比，假电针刺激组、假穴位电针刺激组、电针刺激组脑组织梗死比显著降低(P<0.05)；假电针刺激组与假穴位电针刺激组脑组织梗死比差异无统计学意义(P>0.05)；与假电针刺激组、假穴位电针刺激组相比，电针刺激组脑组织梗死比显著下降。见表1。

2.5各组脑组织病理学改变 正常组脑组织结构完整、形态正常，神经细胞排列规则。模型组脑组织结构不清、组织疏松，神经细胞排列紊乱，胞质着色灰暗、胞核稍增大，染色深。假电针刺激组、假穴位电针刺激组、电针刺激组神经细胞部分恢复，且电针刺激组好于假电针刺激组与假穴位电针刺激组。见图1。

2.6各组脑组织miR-34a及SIRT1蛋白表达 与正常组相比，模型组脑组织miR-34a水平显著升高(P<0.05)，SIRT1蛋白水平显著降低(P<0.05)；与模型组相比，假电针刺激组、假穴位电针刺激组、电针刺激组脑组织miR-34a显著降低(P<0.05)，SIRT1蛋白表达显著升高(P<0.05)；假电针刺激组与假穴位电针刺激组脑组织miR-34a、SIRT1蛋白水平差异无统计学意义(P>0.05)；与假电针刺激组、假穴位电针刺激组相比，电针刺激组脑组织miR-34a显著降低(P<0.05)，SIRT1蛋白表达显著升高(P<0.05)。见表2、图2。

箭头代表神经细胞图1 各组脑组织病理切片(HE，×200)

1～5：正常组，模型组，假电针刺激组，假穴位电针刺激组，电针刺激组图2 各组脑组织SIRT1蛋白

3 讨 论

电针刺激是中医学中针灸的一种疗法，具有针灸和电疗的双重特点，其疗效及安全性已经过验证。普遍认为针刺镇痛是一个生理性调整过程，是痛觉传入信号与穴位传入在中枢神经系统能相互作用的结果，神经、体液因素在其中发挥重要作用〔12，13〕。研究显示，通过对大鼠迷走神经进行电刺激可部分恢复大鼠中动脉阻断/再灌注损伤大鼠脑损伤〔14〕。Shi等〔15〕研究发现，电针刺激可改善缺血缺氧性脑损伤新生大鼠的神经功能，减少脑梗体积，降低脑组织中的炎症因子及兴奋性氨基酸的水平，发挥神经保护作用。本研究结果提示成功构建脑卒中大鼠模型，电刺激、穴位刺激及电针刺激均对脑梗死大鼠神经功能具有一定的恢复作用，而电针刺激疗效远好于假电针刺激与假穴位电针刺激，提示电针刺激对保护动脉闭塞大鼠神经功能，部分恢复梗死比具有优越性，这可能由于电针刺激具有改善神经的传导功能、促进神经再生与修复等功能，可改善神经组织的微血管环境，能增加脊髓和外周神经的神经营养因子，从而提高患者痛阈、增加疼痛的耐受力、降低疼痛的敏感性〔16〕。

miR-34a是位于染色体1p36，主要表达于脑组织〔17〕。周成芳等〔18〕研究显示，大鼠脑缺血再灌注损伤模型中脑组织miR-34a水平异常升高。研究表明，SIRT1是miR-34a的靶蛋白，miR-34a可调控SIRT1参与阿霉素诱导的心肌细胞凋亡〔19〕。SIRT1是一种烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)依赖的蛋白去乙酰化酶，具有延缓细胞衰老的作用〔5〕。近年来，SIRT1的神经保护作用受到广泛关注，Carloni等〔20〕研究显示，脑缺血再灌注损伤过程中，SIRT1可通过抑制p53和核因子(NF)-κB介导的炎症反应和细胞凋亡保护神经损伤。赵秀芹等〔21〕研究发现，丁苯酚注射液通过上调SIRT1表达减轻脑缺血再灌注大鼠脑损伤。本研究表明电针刺激显著降低miR-34a，促进SIRT1蛋白表达，提示电针刺激可能通过协同激活miR-34a/SIRT1通路改善脑卒中大鼠神经功能。

综上所述，电针刺激可能通过激活miR-34a/SIRT1通路，促进大鼠神经功能恢复，本研究也存在一定不足，电针刺激恢复大鼠神经功能的相关通路有待进一步探讨。