益肾坚骨丸质量标准提高研究Δ

陈占功，赵小伟，吴剑坤，夏雪竹，毛克臣

(首都医科大学附属北京中医医院药学部，北京 100010)

首都医科大学附属北京中医医院院内制剂益肾坚骨丸是由熟地黄、菟丝子及山药等12味中药制成的水蜜丸，临床应用多年，功能为补肾填精、强壮筋骨，用于肝肾阴虚引起的骨质疏松及骨关节痛、腰酸腿软、潮热盗汗以及神疲乏力等。原制剂质量标准仅规定了丹参酮ⅡA的薄层色谱鉴别。为提高该制剂的质量控制水平，本研究建立了质量控制方法，以期全面、有效地控制该药质量。

1 材料

1.1 仪器

Agilent-1260型高效液相色谱仪(Agilent公司)，PB203-N型电子天平(METTLER TOLEDO公司)。OLYMPUSC-X43型显微镜(OLYMPUS公司)。

1.2 药品与试剂

益肾坚骨丸(批号：1912092、1912093和2002012，首都医科大学附属北京中医医院制剂室提供)；处方饮片(北京杏林药业有限责任公司)；山茱萸对照药材(批号：120923-200911)、丹参对照药材(批号：120923-201615)、苍术对照药材(批号：120983-201605)、莫诺苷对照品(批号：111998-201602)、马钱苷对照品(批号：111640-201606)均来源于中国食品药品检定研究院；硅胶G(青岛海洋化工厂分厂)；羧甲基纤维素钠(浙江省台州市路桥四甲生化塑料厂)；薄层板[自制：硅胶G-0.5%CMC-Na(质量比为3∶1)，机铺后自然干燥，105 ℃干燥30 min，至干燥器中备用]；所用试剂均为分析纯(北京化学试剂公司)。

2 方法与结果

2.1 显微鉴别

取3批益肾坚骨丸适量，分别粉碎成细粉，置于10×40倍显微镜下观察[1]。

2.1.1 熟地黄显微特征：薄壁组织灰棕色至黑棕色，细胞多皱缩，内含棕色核状物。经3批样品观察，均可检出，见图1。

A.批号：1912092；B.批号：1912093；C.批号：2002012A.batch number：1912092)；B.batch number：1912093)；C.batch number：2002012)图1 益肾坚骨丸中熟地黄黄的显微鉴别图(薄壁组织)Fig 1 Microscopic identification diagram of Radix rehmanniae in Yishen Jiangu pills(parenchymatous tissue)

2.1.2 菟丝子显微特征：种皮表皮细胞和种皮珊状细胞，具光辉带，方中鉴定其种皮珊状细胞。经3批样品观察，均可检出，见图2。

A.批号：1912092；B.批号：1912093；C.批号：2002012A.batch number：1912092;B.batch number：1912093;C.batch number：2002012图2 益肾坚骨丸中菟丝子的显微鉴别图(种皮珊状细胞)Fig 2 Microscopic identification diagram of Semen cuscutae in Yishen Jiangu pills (testa cells)

2.1.3 茯苓显微特征：不规则颗粒状团块和分枝状团块无色，遇水合氯醛试液溶化；菌丝无色或淡棕色，细长，稍弯曲，有分枝，直径3～8 μm。为便于在复方制剂中寻找，本研究选用加水合氯醛，不加热透化观察。经3批样品观察，均可检出，见图3。

A.批号：1912092；B.批号：1912093；C.批号：2002012A.batch number：1912092;B.batch number：1912093;C.batch number：2002012图3 益肾坚骨丸中茯苓的显微鉴别图(不规则颗粒状团块和分枝状团块)Fig 3 Microscopic identification diagram of Poria in Yishen Jiangu pills(irregular granular agglomerates and branched agglomerates)

2.1.4 山药显微特征：淀粉粒单粒扁圆形、三角状卵形、类圆形或矩圆形，直径8～35 μm，脐点点状、人字状、十字状或短缝状，可见层纹；草酸钙针晶存在于黏液细胞中。本研究将淀粉粒和草酸钙针晶一起用于鉴别山药，经3批样品观察，均可检出3批样品，见图4—5。

A.批号：1912092；B.批号：1912093；C.批号：2002012A.batch number：1912092;B.batch number：1912093;C.batch number：2002012图4 益肾坚骨丸中山药的显微鉴别图(淀粉粒)Fig 4 Microscopic identification diagram of Rhizoma dioscoreae in Yishen Jiangu pills(starch granule)

A.批号：1912092；B.批号：1912093；F.批号：2002012A.batch number：1912092;B.batch number：1912093;C.batch number：2002012图5 益肾坚骨丸中山药的显微鉴别图(草酸钙针晶)Fig 5 Microscopic identification diagram of Rhizoma dioscoreae in Yishen Jiangu pills(calcium oxalate needle crystal)

2.1.5 泽泻显微特征：薄壁细胞类圆形，具多数椭圆形纹孔，集成纹孔群。经3批样品观察，均可检出，见图6。

A.批号：1912092；B.批号：1912093；C.批号：2002012A.batch number：1912092;B.batch number：1912093;C.batch number：2002012图6 益肾坚骨丸中泽泻的显微鉴别图(薄壁细胞)Fig 6 Microscopic identification diagram of Rhizoma alismatis in Yishen Jiangu pills(parenchymatous tissue)

2.2 薄层色谱鉴别

取益肾坚骨丸12 g，粉碎成细粉，以乙醚为溶剂进行超声提取，共2次，每次25 ml，15 min，滤过，合并提取液，挥尽溶剂，剩余残渣加乙酸乙酯1 ml溶解，作为供试品溶液。另取丹参对照药材0.5 g、山茱萸对照药材0.5 g、苍术对照药材0.5 g，以相同方法制成各对照药材溶液。另按益肾坚骨丸处方中药味比例，分别取不含山茱萸、丹参和苍术的其他中药材饮片，并按益肾坚骨丸制备工艺制成空白制剂，再按供试品溶液制备方法制成丹参阴性对照液、山茱萸阴性对照液和苍术阴性对照液。依照《中华人民共和国药典：四部》(2015年版)通则0502收载的薄层色谱法试验，吸取供试品溶液10 μl、阴性对照液各10 μl及对照药材溶液各3 μl，分别点于同一块硅胶G薄层板上，采用石油醚(60～90 ℃)-丙酮(V∶V=9∶2)展开，取出，晾干，日光下检视，薄层色谱图见图7。结果表明，在供试品色谱中，与丹参对照药材色谱相应位置处可见相同颜色的斑点，丹参阴性对照无干扰。继续喷以10%硫酸乙醇溶液，加热至斑点清晰，日光下检视，薄层色谱图见图8。结果表明，在供试品色谱中，与山茱萸、苍术对照药材色谱相应位置处可见相同颜色的斑点，山茱萸阴性对照和苍术阴性对照均无干扰。

1.丹参阴性对照；2.丹参对照药材；3.供试液(批号：1912092)；4.供试液(批号：1912093)；5.供试液(批号：2002012)；6.苍术对照药材；7.苍术阴性对照；8.山茱萸阴性对照；9.山茱萸对照药材；10.供试液(批号：1912092)；11.供试液(批号：1912093)；12.供试液(批号：2002012)1.Salviae miltiorrhizae for negative control;2.Salviae miltiorrhizae for contrast medicinal material;3.test solution(batch number：1912092);4.test solution(batch number：1912093);5.test solution(batch number：2002012);6.Atractylodes macrocephala for contrast medicinal material;7.Atractylodes macrocephala for negative control;8.Cornus officinalis for contrast medicinal material;9.Cornus officinalis for negative control;10.test solution(batch number：1912092);11.test solution(batch number：1912093);12.test solution(batch number：2002012)图7 丹参薄层色谱图Fig 7 Thin layer chromatogram of salviae miltiorrhizae

2.3 莫诺苷及马钱苷的含量测定

2.3.1 色谱条件及系统适应性[1]：色谱柱采用十八烷基硅烷键合硅胶柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)。流动相以乙腈为A相、0.3%磷酸溶液为B相，梯度洗脱程序为0～20 min，7%A；20～50 min，7%～20%A。检测波长为240 nm，理论板数按马钱苷峰计算应≥10 000。

2.3.2 对照品溶液的制备：精密称取一定量的莫诺苷、马钱苷对照品，加80%甲醇制成每1 ml含莫诺苷46 μg、马钱苷49 μg的混合溶液，即得。

2.3.3 供试品溶液的制备：取益肾坚骨丸，粉碎成细粉，精密称定6 g，置于具塞锥形瓶中，精密加入80%甲醇25 ml，称定质量，加热回流提取1 h，冷却后再次称定质量，用80%甲醇补足减少的质量，摇匀，滤过，滤液作为供试品溶液。

2.3.4 阴性对照溶液的制备：按益肾坚骨丸处方，取不含山茱萸的其他中药材饮片，按益肾坚骨丸制法及供试品溶液制备方法制成山茱萸阴性对照溶液。

2.3.5 专属性试验：分别精密吸取莫诺苷、马钱苷对照品混合溶液、供试品溶液及阴性对照溶液，在“2.3.1”项下色谱条件进行测定，进样10 μl，记录色谱图，结果见图9。可见，在该色谱条件下阴性对照无干扰，专属性强。

2.3.6 线性关系的考察：精密吸取莫诺苷(46 μg/ml)、马钱苷对照品溶液(49 μg/ml)分别进样8、10、12、14、16及18 μl，根据“2.3.1”项下色谱条件进行测定，记录色谱图，测定各峰面积。以峰面积积分值为纵坐标(Y)，进样量为横坐标(X)，求得莫诺苷回归方程Y=1 468X-170.4(r2=0.999 9)，马钱苷回归方程Y=1 702X-11.86，(r2=0.999 9)，表明莫诺苷在0.368～0.0.828 μg范围内、马钱苷在0.392～0.882 μg范围内进样量与峰面积积分值呈良好的线性关系。

2.3.7 稳定性试验：精密吸取同一供试品溶液各10 μl，于0、2、4、6及8 h分别进样，测定峰面积，测得莫诺苷峰面积RSD为0.56%，马钱苷峰面积RSD为0.63%。结果表明，样品供试液在8 h内稳定性良好。

2.3.8 精密度试验：精密吸取莫诺苷、马钱苷对照品溶液10 μl，连续进样6次，测定峰面积，计算得莫诺苷RSD为0.16%，马钱苷RSD为0.18%，表明仪器精密度良好。

2.3.9 重复性试验：取同一批号益肾坚骨丸样品6份，按“2.3.3”项下供试品溶液制备方法进行制备，进样量10 μl，测定峰面积值并计算含量，结果显示，莫诺苷RSD为0.59%，马钱苷RSD为2.36%，表明重复性良好。

2.3.10 回收率试验：精密称定已知含量的益肾坚骨丸样品6份，加入一定量的混合对照品溶液，其余操作步骤同“2.3.3”项下供试品溶液制备方法，采用“2.3.1”项下色谱条件进行测定，计算加样回收率，结果见表1—2。

表1 莫诺苷加样回收率试验结果Tab 1 Results of modified sample recovery test of morroniside

2.3.11 样品含量测定：取3个批号的益肾坚骨丸样品各约6 g，精密称定，采用“2.3.3”项下供试品溶液制备方法制得供试品溶液，采用“2.3.1”项下的色谱条件进样测定，进样量10 μl，记录莫诺苷、马钱苷的峰面积，并计算其含量，结果见表3。

A.供试品；B.对照品；C.阴性对照品A.test substance;B.control substance;C.negative control substance图9 莫诺苷及马钱苷含量测定的HPLC图谱Fig 9 HPLC of the content determination of morroniside and strychnine

表2 马钱苷加样回收率试验结果Tab 2 Result of modified sample recovery test of strychnine

表3 样品的含量测定结果(mg/g)Tab 3 Result of content measurement of sample(mg/g)

3 讨论

本研究使用同一种展开剂同时鉴别3种药材，具有简便、经济和环保的特点，效果较佳。

本研究还对苍术、牡丹皮及黄精进行了薄层色谱鉴别试验研究。本制剂中苍术的量非常少，在取样品量达到12 g时，才可以显出1个对应的斑点。曾进行展开剂的筛选：(1)石油醚(30～60 ℃)-乙酸乙酯(V∶V=10∶0.5)[2]；(2)石油醚(60～90 ℃)-丙酮(V∶V=9∶2)[1]。由于展开剂(2)可以使丹参、山茱萸同时得到鉴别，而且分离效果较佳，故选用展开剂(2)。牡丹皮薄层层析鉴别，对展开系统进行了筛选[3-4]，结果显示，空白中均有干扰，因此未列入正文。

山茱萸具有补益肝肾、收涩固脱的功效[5]。现代药理学研究结果表明，山茱萸在治疗炎症、保护心脑血管和抗氧化等方面的功效突出[6]。其主要成分有环稀醚萜、三萜及鞣质等，主要活性成分为环烯醚萜苷类[7]，其中马钱苷、莫诺苷含量最高[8]，而现有研究也主要聚焦于山茱萸的主要组分的含量测定[9-11]。本研究将莫诺苷和马钱苷作为益肾坚骨丸中的主要含量测定指标。

益肾坚骨丸作为院内制剂在临床上使用多年，对于骨质疏松有很好的疗效。近年来，随着人口老龄化进程加剧，骨质疏松症的发病率逐年升高，目前已成为严重危害国民身体健康的公共健康问题[12]。据世界卫生组织统计，目前骨质疏松症的发病率已稳居世界多发病、常见病发病率的第7位,老年人骨质疏松症的高发病率已经仅略次于心脑血管病,成为全球性的重要健康问题[13]。刘明慧等[14]的研究结果表明，骨质疏松症的病因较为复杂，应予以辨证施治。李颖等[15]认为，骨质疏松症的病机特点可主要概括为多瘀、多虚。近年来，随着中医学的不断发展与实践，于骨质疏松症治疗方面获取了显著的成效[16]。

特色制剂来源于验方、协定处方，这些特色制剂临床使用方便，又体现了学科发展的水平[17]。特别是在综合医院，特色产品和特色服务是重中之重，而院内制剂可以满足要求，可作为“差异化服务”，成为医院的特色产品，提供个性化和人性化的服务，且院内制剂具有市场中无可替代品、治疗作用明确、专科特色强且毒副作用低等特点[18-19]。

益肾坚骨丸在临床上应用多年，但一直以来缺乏科学而全面的质量标准。本研究建立了该药的定性与定量的质量控制方法，以促进中药制剂的传承与发展。