超高压处理对热鲜猪肉中乳酸的影响

张慧娟，潘见

1.广东力泰德食品工程有限公司（佛山 528225）；2.合肥工业大学农产品生物化工教育部工程研究中心（合肥 230009）

乳酸是肌肉组织内的糖类代谢产物[1]。动物屠宰后，要经历成熟过程，期间肌肉中的糖原先水解成葡萄糖，再经过无氧酵解变成乳酸，糖酵解过程生成的乳酸不再像活体动物那样被转运到肝脏中而后合成肝糖原或通过血液循环而被排除到体外，而是在肌肉细胞内蓄积起来，导致pH的下降[2-3]。同时，乳酸的大量生成会造成冷却肉的保水性及嫩度不同程度下降，这与PSE（pale，soft and exudative）肉和DFD（dark，firm and dry）肉的产生有密切关系[4]。因此乳酸含量对肉的品质影响尤为重要。

超高压能够抑制新鲜猪肉的僵化过程[5]，超高压技术的应用未来可能替代传统的吊挂排酸，为肉制品的加工提供新的方法。已有众多学者对超高压技术在肉中的应用做了大量的探索[6-8]，但超高压对猪肉中乳酸含量的影响尚未见报道。通过探索超高压对肉中乳酸含量的影响，并探索其变化的机理，以期为超高压技术在肉品工业上的应用提供方法的完善与创新。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

猪腰肉（合肥市周谷堆农贸市场）；乳酸标样（纯度99.9%，Sigma公司）；辅酶烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）（百灵威上海公司）；乳酸脱氢酶（Lactate dehydrogenase，LDH）（Promega公司）；牛磷酸化腺苷酸活化蛋白激酶酶联免疫分析试剂盒（上海远慕生物科技有限公司）；甲醇（国产色谱纯，生工生物工程（上海）股份有限公司）；高氯酸（国产优级纯，国药集团化学试剂有限公司）；磷酸二氢铵、磷酸、乙酸钠、氢氧化钠（国产分析纯，国药集团化学试剂有限公司）；D-甘露糖醇（D-mannitol）、Tris-base（美国Amresco公司）；乙二胺四乙酸（EDTA）、二硫苏糖醇（dithiohthreitol，DTT）、乙二醇二乙醚二胺四乙酸（EGTA）（Sigma公司）；NaF、焦磷酸钠（天津永大化学试剂厂）；超纯水（实验室自制）；中速定量滤纸（杭州特种纸业有限公司）；0.45 μm一次性针头微孔滤膜（江苏汉邦科技有限公司）；1 mL针器注射器（江苏治宇医疗器械有限公司）。

1.2 仪器与设备

1L超高压系统（包头科发科技有限公司）；Agilent 1260高效液相系统、Agilent C18（5 μm，Φ4.6 mm×250 mm）色谱柱（美国Agilent Technologies）；KH-1500SP超声仪（昆山禾创超声仪器有限公司）；FM200分散器（德国FLUKO公司）；3K15高速冷冻离心机（Sigma公司）；UV-1600紫外分光光度计（北京瑞利分析仪器公司）；pH计（上海雷磁科学仪器有限公司）；BCD-220VM（E）冰箱（美的集团）；FC104电子分析天平（上海精密仪器仪表有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 肉样的准备

1.3.1.1 成熟肉样的准备

样品来源于当地屠宰场，1岁的皖北猪，每只体重为90～100 kg，按常规方法屠宰，之后在4 ℃下跟腱吊挂排酸24 h。吊挂结束后，从尸体中的腰部取出部分肉样，并将这些肉样平行于肌肉纤维切成大小为长8 cm×宽5 cm×高5 cm的小块，分别用聚乙烯袋单独真空包装，之后储存在-18 ℃冰箱中，直到进一步的使用。

1.3.1.2 超高压肉样的准备

从常规屠宰，未吊挂的、1岁、每只体重为90～100 kg的皖北猪尸体上取得腰肉样品，共制备30个与1.3.1.1相同大小的样本。每个样品单独用聚乙烯袋真空包装，并立即进行超高压处理。

肉样在包装后分别转移到超高压釜中。加压介质为油，初始温度20 ℃（±3 ℃）。试验采取不同压力处理（分别为100，200，300和400 MPa），处理时间为10 min，后储存在-18 ℃冰箱中，用于进行下一步分析。压力分别在3～5 MPa/s之间增加和减少。

未处理的样品保留作为对照处理。超高压肉样的制备在屠宰后2 h内完成。

1.3.2 酶液准备

取适量的LDH，用100 mL生理盐水溶解。再分别将10 mL酶液倒入聚乙烯袋中真空包装，并立即进行超高压处理（分别为100，200，300和400 MPa），然后储存在4 ℃冰箱中。

未处理的样品保留作为对照处理。

1.3.3 试验方法

1.3.3.1 乳酸含量测定

1.3.3.1.1 色谱条件

参考朱学伸等[4]的方法，Agilent 1260 HPLC系统；Agilent C18（5 μm，Φ4.6 mm×250 mm）色谱柱；以甲醇与10 mmol/L磷酸二氢铵混合液为流动相，体积比为5∶95，配制前磷酸二氢铵用体积分数为50%的磷酸溶液调节pH至2.2，混合液在使用前经0.45 μm的合成纤维素膜真空抽滤并超声脱气；0.7 mL/min流速；25℃柱温；20 μL进样量；210 nm紫外检测波长。

1.3.3.1.2 样品前处理

参考Immonen等[9]的方法，从冰箱中取出样品，称取1.0 g肉样，剪碎后放入离心管中，然后加入10 mL的1 mol/L高氯酸，并在13 500 r/min条件下匀浆30 s。后匀浆液在5 500 r/min、4 ℃条件下离心10 min，将上清液经定量滤纸过滤置于25 mL容量瓶中，滤渣用10 mL高氯酸洗涤，并转移至离心管中，再次在13 500 r/min的条件下匀浆30 s，后再次用5 500 r/min、4 ℃的条件离心10 min，上清液经定量滤纸过滤，与前一次滤液合并转入置于25 mL容量瓶中，并精准定容至25 mL。提取液在4 ℃条件下保存待检测。检测前提取液需过0.45 μm滤膜。

1.3.3.1.3 标准溶液配制及样品测定

准确称取100 mg乳酸标样，用超纯水定容至10 mL。然后用超纯水逐级稀释为20，40，60，80，200和250 μg/L的乳酸标准溶液。按照1.3.3.1的色谱条件进样分析，每个质量浓度进样3次。以乳酸质量浓度为横坐标，色谱峰面积为纵坐标绘制标准曲线。

肉样经1.3.1处理后，再按照1.3.3.1.2制得提取液，提取液按1.3.3.1.1的色谱条件测定。

1.3.3.2 酶活性测定方法

1.3.3.2.1 磷酸腺苷活化蛋白激酶（AMP-activated protein kinase，AMPK）活性检测

参照杨雅媛等[10]的方法并作修改，取0.5 g冷冻的肉样，剪碎后置于离心管中，加入预冷的匀浆液（pH 7.4，1 mmol/L EGTA，1 mmol/L EDTA，1 mmol/L DTT，5 mmol/L焦磷酸钠，50 mmol/L NaF，0.05 mol/L Tris-HCl，0.25 mol/LD-甘露醇）冰浴匀浆（每12 s匀浆1次，间隙20 s，重复5次）。然后在10 000 r/min、4 ℃的条件下离心5 min，取上清液用于AMPK活力的测定。测定方法参照试剂盒进行。

1.3.3.2.2 LDH活性检测

总反应体系包括 50 mmol/L、pH 5.5的乙酸钠缓冲液，0.2 mmol/L NADH，5 mmol/L乳酸，对照组中不含NADH，其他成分相同。混匀后于30 ℃保温5 min，加入适量的酶液。检测在340 nm处的吸光度。

1.3.3.3 数据分析

试验数据采用 Excel 进行统计，采用SPSS进行分析，对各个指标进行差异性分析时采用Duncan方法，当p＜0.05时，表明对其影响差异显著。

2 结果与分析

2.1 超高压处理对肉中乳酸含量的影响

此次测定的乳酸含量和峰面积之间的回归方程为Y=1.252 5X+5.573 2，R2=0.997 2，由此表明当乳酸质量浓度在0～250 μg/mL范围内时，乳酸质量浓度和峰面积之间线性良好。

不同处理条件，猪肉中的乳酸含量变化如图1所示。与新鲜肉相比，压力对猪肉中乳酸的变化显著（p＜0.05）。

图1 处理方法对猪肉中乳酸含量的影响

由图1的结果可知，猪肉经过吊挂成熟过程后，肉中的乳酸含量有小幅度的上升，由原来的0.83 mg/g上升为0.95 mg/g，说明肉的成熟过程是产生乳酸的过程。

低于或等于200 MPa压力的处理，肉中的乳酸含量降低，可能是低于或等于200 MPa压力抑制了乳酸的生产。压力在300～400 MPa范围内，压力的作用能够引起乳酸含量的显著变化，处理后猪肉中的乳酸含量明显高于新鲜肉和成熟肉。当压力从200 MPa升高到400 MPa时，乳酸含量持续增加，400 MPa肉中的乳酸含量达到最高，为5.18 mg/g。

Kijowski等[11]研究表明，乳酸能通过对肌原纤维和结缔组织的弱化来改善肉的嫩度。在一定程度上，乳酸的抑菌作用可以显著延长肉制品的贮藏期[12]。

正常情况下，乳酸的不断生成，造成肉的pH不断下降，乳酸生成速率下降。但此时乳酸短时间内形成大量堆积，究其原因还需从乳酸的产生机制讨论。

猪肉中乳酸的产生路线如图2所示。糖原被分解生成丙酮酸，在缺氧的条件下丙酮酸进一步被还原为乳酸。从图中可以看出影响乳酸生成的直接因素为底物丙酮酸的含量和LDH的酶活大小。而丙酮酸的含量主要受糖酵解的影响。

图2 猪肉中乳酸生成的线路图

朱庸平[13]研究表明，在糖酵解产生乳酸的过程中，糖原是足够的，直到猪肉彻底熟化，糖原仍有剩余，产生乳酸的多少与糖酵解潜力有关。在糖酵解过程中，相关限速酶活性是影响糖酵解进程的关键因素[14]。在这些糖酵解限速酶中，糖原磷酸化酶（glycogen phosphorylase）和磷酸果糖激酶（phosphofructokinase）活性可以被腺苷酸蛋白活化激酶调控[15]。AMPK活性被激活后，可以直接磷酸化糖酵解关键酶并提高其活性，进而促进糖酵解[16]。

在无氧条件下，糖酵解的中间产物丙酮酸在LDH的作用下发生脱羧和还原反应，其中还原剂是NADH，最终生成乳酸和氧化态的NAD+[17]。超高压对乳酸含量的影响是否是因为超高压对AMPK和LDH的影响，将做进一步的讨论。

2.2 超高压对AMPK活性的影响

AMPK是一个异源三聚体，由α、β和γ三种亚基组成，能被机体各种刺激激活[18]。酶分子有一级、二级、三级和四级结构，不同层次的结构对酶分子具有不同的意义。超高压通过破坏蛋白质的二级、三级和四级结构的非共价键，而不影响一级结构的共价键，从而使酶失活或增活。二级结构也是仅在非常高的压力下才会发生结构调整，三级和四级结构受到压力的影响最大[19]。蛋白质结构的改变，造成了酶活大小的变化。

AMPK的活性高应该代表着糖酵解的速度也高[20]，那么丙酮酸的含量也将相应地提高，这将加快乳酸的生成。

压力对AMPK活性的影响如图3所示。与对照组相比，压力对AMPK活性的影响显著（p＜0.05）。

图3 压力对AMPK活性的影响

由图3的结果可知，在压力低于或等于200 MPa时，随着压力的升高，AMPK活性降低，但幅度较小，这说明，在此压力区间，压力对AMPK活性有一定的抑制作用。当压力在200～400 MPa时，随着压力的升高，AMPK活性也显著升高，且在400 MPa时达到最大值，这说明，较高的压力改变了AMPK的结构，使AMPK被激活。

从图2和图1的对比可知，在压力低于或等于200 MPa时，AMPK活性被抑制，降低了糖酵解的速度，进而降低了乳酸的生成；当压力在200～400 MPa时，压力越高，AMPK活性越大，糖酵解的速度越快，乳酸的积累越多。

2.3 超高压对LDH活性的影响

LDH是一种参与新陈代谢的十分重要的蛋白酶，广泛存在于植物、动物、原核生物中。它可以催化底物丙酮酸和乳酸的相互转化。反应发生依赖于：NADH将H转移给丙酮酸羰基的C原子，同时活性部位一个特定的已经质子化的组氨酸（histidine），将质子转给丙酮酸羰基的O原子，丙酮酸在它的羰基方向上同时加上了两个氢，变成了乳酸[21-22]。

压力对LDH活性的影响见图4。试验期间超高压处理后LDH活性与对照组有显著性差异（p＜0.05）。在0～200 MPa压力范围，LDH活性随压力升高而有小幅度的降低，在200 MPa时，LDH活性为对照组的0.87倍。在200～300 MPa压力范围内，LDH活性随压力升高而升高，并在300 MPa时，活性达到最大，为对照组的1.97倍。在300～400 MPa压力范围内，LDH活性随压力升高而降低，在400 MPa时，LDH活性为对照组的1.58倍。

图4 压力对LDH活性的影响

基于这些结果得出以下结论：200～400 MPa的压力处理能够显著提高LDH的活性，进而使得糖酵解产生的丙酮酸在LDH的作用下大量生产乳酸，使得乳酸得到积累。

3 结论

较未处理的新鲜猪肉，0～200 MPa压力的处理，使得肉中的乳酸含量降低；300～400 MPa压力的处理，猪肉中的乳酸含量明显高于新鲜肉和成熟肉，并在400 MPa处理后，肉中的乳酸含量达到最高。

通过对乳酸产生机制中关键酶活的检测，得到如下原因：

在压力低于或等于200 MPa时，AMPK活性被抑制，降低了糖酵解的速度，同时LDH活性也有小幅度的降低，降低了乳酸的生成；当压力在200～400 MPa时，压力越高，AMPK活性越大，糖酵解的速度越快，在此压力范围内，LDH酶活处于激活状态，促进了乳酸的积累。