基于网络药理学的三仙汤治疗骨质疏松症作用机制研究

戴梦竹 任路 何信用 王群 徐宁阳 陈文娜

1.辽宁中医药大学研究生学院，辽宁 沈阳 110847

2.辽宁中医药大学医学检验学院，辽宁 沈阳 110847

骨质疏松症 (osteoporosis, OP) 是一种以骨组织微结构损坏，骨量减少导致骨骼脆性增加易发生骨折的常见骨病[1]，已成为严重影响人群生活质量的公共健康问题。根据我国2013年人口普查结果推测，至2050年60以上的老人约4亿，中国骨质疏松症的患者将达到2.12亿之多[2]。目前临床通常采用西药治疗，如骨形成促进剂、骨吸收抑制剂、及其他机制类药物[3]。近年研究表明运用中医中药治疗骨质疏松的效果显著, 因其价格价廉、不良反应小、整体调节、标本兼治彰显了独特的优势[4]，越来越被大众所认可。三仙汤出自国医圣手干祖望，俗称“中药小激素”，是由淫羊藿(仙灵脾)、仙茅、仙鹤草三味药组成。因药味数少，价格低廉效果好，临床上经常使用。姜良铎教授用三仙汤治疗骨质疏松等疾病疗效显著。秦腊梅[5]证实三仙汤对去卵巢大鼠骨生物力学性能有改善的作用，可用于治疗骨质疏松。现代药理实验表明，三仙汤通过提高血钙、血磷、血清碱性磷酸酶水平，减少尿钙、尿磷含量的机制，促进成骨细胞的增殖[6-7]。但其有效成分和分子机制等尚不明确。传统中医药文化博大精深却一直很难被世界所认可，其多成分-多靶点-多通路作用的复杂性导致了中医药在国际化的发展进程中步履艰难[8]。近年来随着中医药研究的不断深入，生物信息学的蓬勃发展也给中医药的机制研究带来了新的方向。基于此，本文应用网络药理学的方法，揭示三仙汤干预OP的分子作用机制，为其临床应用提供理论支撑。

1 材料和方法

1.1 仙汤中有效成分及靶点获得

通过使用中药系统药理学数据库与分析平台(TCMSP)[9]检索三仙汤中淫羊藿(仙灵脾)、仙茅、仙鹤草三味中药的化学成分。在此结果上根据筛选条件化合物类药性(drug-likeness, DL)≥0.18，口服生物利用度(oral bioavailability, OB)≥30 %筛选药物的有效活性成分及相应的成分靶点[10]。同时通过Uniprot数据库，将已筛选出的药物成分靶点名称进行标准化命名，建立药物活性成分靶点数据集。

1.2 骨质疏松症(OP)相关靶点获得

在两大常用数据库Genecards(https://www.genecards.org/)[11]和OMIM(https://omim.org/)[12]中输入检索词：osteoporosis，将上述预测靶基因合并作为疾病相关靶标数据集。

1.3 药物-疾病的交集靶点及网络构建

在http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/网站将药物和疾病靶基因取交集，采用Cytoscape 3.7.1绘制药物、疾病、靶基因网络图。再将筛选到的交集基因提交至String网站(https://string-db.org/)[13]，minimum required interaction score为medium confidence: 0.400生成PPI互作网络图。利用perl语言，提取关键基因连接度蛋白统计条图(排名前30)，生成所有节点连接度统计结果文件。PPI互作网络图是从生物化学、信号转导等角度研究疾病相关蛋白质分子之间的关联性[14]。将化合物-药物靶点网络图导入Cytoscape进行Degree值分析，将筛选出的核心基因与PPI网络图得出的结果进行比对，得到可信度较高的核心基因。应用R 3.6.0软件，安装RSQLite包及org.Hs.eg.db包，将药物-疾病交集基因名称转换为基因ID，为GO分析和KEGG分析做准备。

1.4 GO生物学过程富集分析和KEGG代谢通路富集分析

利用R 3.6.0软件，安装colorspace、stringi、DOSE、clusterProfiler、pathview、ggplot2等程集包进行GO(gene ontology)及KEGG(KEGG pathway analysis)富集分析，以P<0.01 且从小到大排序作为条件，筛选出前20条最具有统计学意义的条图、气泡图以及关键信号通路图，并将其结果进行可视化处理。

2 结果

2.1 三仙汤活性化合物的筛选

TCMSP数据库平台分析筛选出活性化合物共35个，见表1。

表1 三仙汤活性化合物信息

2.2 OP与三仙汤的交集分析

通过Genecards和OMIM数据库，用疾病名称“osteoporosis”进行检索，去除重复后可得到 3 490 个与OP 相关的靶点。通过数据库我们得到三仙汤有197个作用靶点。将 3 490个疾病靶点与 197 个药物成分靶点输入Draw Venny Diagram在线程序软件绘制韦恩图，取其交集后获得疾病-药物共同靶点 127 个，见图 1。

图1 疾病靶点-药物靶点韦恩图

2.3 化合物成分-药物靶点网络图

在化合物-靶点网络中包括155个节点，其中28个是化合物节点，详见表2。127个药物疾病交集靶点节点，紫色三角形节点代表化合物节点，绿色圆形代表药物靶点节点，连线代表着化合物与靶点之间具备相互作用关系，见图2。

表2 化合物节点

图2 三仙汤成分-靶点网络图

2.4 三仙汤与OP蛋白质相互作用网络(PPI)的构建

将上述药物与疾病交叉共有的127个靶蛋白交集上传至STRING数据库平台进行分析，得到了PPI网络图，见图 3。共有127个节点，2 225条边，平均节点度为35。图中线条代表蛋白质与蛋白质相互作用关系，连接靶点之间线条的数量与该靶点作为潜在靶点的可能性呈正相关。根据PPI网络的连线结果通过柱状图可视化，见图4，可以得出蛋白激酶(AKT1)、白介素6(IL-6)、血管内皮生长因子(VEGFA)等基因与其他基因联系最为密切，为PPI网络中的核心基因。对化合物-药物靶点网络进行Network Analyze分析，Degree值越大表示该节点之间相连的数目越多，越可能成为核心靶点。将筛选出Degree值大于5的基因与PPI网络核心基因一同输入Draw Venny Diagram软件绘制韦恩图，见图5。结果得到20个交集核心基因：AKT1、IL-6、VEGFA、JUN、PPARG、IL10、MAPK1、MAPK14、MMP2、RELA、HMOX1、PTGS2、EGFR、ICAM1、BCL2L1、CASP3、CCND1、MMP9、ESR1、ERBB2。

图3 三仙汤靶点 PPI 网络

图4 每个基因链接节点数

图5 化合物-药物核心靶点与PPI核心靶点韦恩图

2.5 靶点GO 生物过程和 KEGG 通路富集分析

为进一步分析三仙汤作用于骨质疏松症的127个交集靶点的机制，进行了GO、KEGG富集分析，得到其基因的功能以及主要的信号通路。分析得到132个生物学过程。结果显示(根据P值升序选取排名前20位)，潜在关键靶基因涉及核受体活性、转录因子活性、类固醇激素受体活性等。见图6，表3。猜测这些功能可能是三仙汤治疗OP 的重要生物过程。此外，KEGG富集得到150条信号通路。结果显示(根据P值大小选取排名前20位)，涉及AGE-RAGE信号通路、流体剪切应力与动脉粥样硬化信号通路、IL-17信号通路等，猜测这些可能是三仙汤治疗OP最重要的信号通路。见图7，表4。

表3 GO生物学过程富集结果

表4 KEGG信号通路富集结果

图6 GO 生物学过程分析

图7 KEGG 信号通路富集分析

3 讨论

三仙汤由淫羊藿(仙灵脾)、仙茅、仙鹤草组成。以上3味药联合使用，可以补虚扶正、安神益气。现代研究指出，三仙汤具有激素或者类激素的作用，可调控内分泌系统以及卵巢、雌性激素的感受器受体[15]。在骨质疏松的调节方面，集中表现在加强成骨细胞的活性以及控制破骨细胞的骨代谢能力，提高去卵巢大鼠血钙、血磷、血清ALP水平，降低尿钙、尿磷浓度等[16]。淫羊藿具有抗肿瘤、抗炎、免疫抑制、抗氧化等作用[17-18]，可以刺激成骨细胞的活性, 抑制破骨细胞产生[19]。仙茅提取物能够提高血清骨钙素的水平，降低脱氧吡啶啉的含量[20]。仙鹤草可提高抗炎因子表达[21]。

为系统地研究三仙汤治疗骨质疏松症的确切靶点，本文采用了网络药理学的方法，筛出28个三仙汤的主要活性成分以及127个治疗靶点。治疗OP的核心靶标主要有AKT1、IL-6、VEGF、JUN等，这些靶点通过分子、细胞、生物过程层面作用于OP，主要影响核受体活性、转录因子活性、类固醇激素受体活性、细胞因子受体结合、蛋白质异二聚活性、血红素结合等生物学功能。已有文献报导，激活后的AKT可以通过RANK/RANKL信号调控破骨细胞的分化[22]。白介素6为体内重要的炎症因子，周游等[23]发现白IL-6的升高会促进破骨细胞的分泌, 抑制骨生成，被认为是调节骨吸收的重要细胞因子。血管内皮生长因子(VEGF)是最活跃的促血管生成因子，能促进血管内皮细胞的分裂，李建民等[24]发现VEGF减少，血管内皮易损伤，微循环发生障碍就会影响骨质代谢，骨形成降低，产生OP。JUN为JAK/STAT信号通路中重要基因，可被外界刺激快速激活，提高JUN的表达可以促进成骨细胞增殖分化，改善OP[25]。KEGG结果发现了150条信号通路，主要包括AGE-RAGE信号通路、动脉粥样硬化信号通路、IL-17信号通路、前列腺癌通路、肿瘤坏死因子(TNF)信号通路等。研究发现改变AGEs/RAGE/Nox4/NF-κB信号通路中相关蛋白的含量，可以减轻氧化应激损伤，防治骨质疏松[26]。流行病学表示，动脉粥样硬化与OP具有一定的关联性，IL-6、TNF等促炎因子会促使血管发生动脉粥样硬化，导致供血不足，骨形成减少[27]。张国权等[28]发现，IL-17可促进合成TNF-α, 并且上调IL-6、RANKL、M-CSF等的表达，促进破骨细胞的分化发育，增强骨组织炎性反应。相关文献表明前列腺癌信号通路[29]、TNF信号通路[30]等也会影响到骨质代谢。通过分析三仙汤主要通过影响细胞分化、凋亡、炎症、氧化应激反应等多种复杂的生物学过程发挥抗骨质疏松的作用。这与现有的相关研究结果基本相同，体现了本研究预测结果具有可信度。同时也体现了体内代谢是互相关联，相互协同的，对于骨质疏松症的医治应该考虑与其他系统的相互作用，从而进行多靶点、多通路协同治疗，仅从局部所在通路入手太过片面。网络药理学的这种系统性、整体性研究特点，与中医治病原则不谋而合[31]。基于“药物-成分-靶点-疾病-通路”的网络药理学分析结果能有效地揭示三仙汤治疗骨质疏松可能存在的活性成分及其作用机制，为中药方剂对疾病的研究提供了新的研究思路，后续将在此研究基础上对相关靶点进一步优化实验设计。但本研究只是借助各种网络大数据资源平台所预测的结果，此外，考虑各种数据库的更新时效性以及数据文章选用的可信度，使得网络药理学的研究有着一定的困难，因此课题组将在近期对预测的结果加以实验验证，以确保数据的可行性。