山药-黄芪药对治疗2 型糖尿病性骨质疏松的网络药理学机制研究

赵元 李香斌 张尚斌 陈剑平*

1. 广州中医药大学第四临床医学院，广东 深圳 518033

2. 深圳市中医院/深圳市医院中药制剂研究重点实验室，广东 深圳 518033

3. 北京中医药大学深圳医院，广东 深圳 518172

2 型糖尿病性骨质疏松(type 2 diabetic osteoporosis，T2DOP)是糖尿病常见的并发症之一，是一种全身性代谢性骨病。T2DOP的发病率随糖尿病患者群体的不断扩大而逐年升高，而中国糖尿病患者骨质疏松的发病率为40%～66%[1]。T2DOP患者因骨脆性和微血管并发症导致的微裂纹而极易引起骨折[2]，不仅严重影响患者生活质量，而且给家庭和社会带来沉重的经济负担。现代医学的治疗原则主要为控制原发病和补充钙剂及维生素D[3]，但效果不显著。中医药作用的多靶点性在临床治疗多因素影响的复杂的T2DOP有一定的优势。在传统中医学中，T2DOP属于“消渴”合并“骨痿”范畴，肾虚和脾虚是其重要病机[1]。山药和黄芪始载于《神农本草经》并列为上品，山药，补脾养阴，生津益肺，强肾固精；黄芪，补气升阳，益水之源，生津养血。二药相配补脾固肾，益气生津，二者一阴一阳，相互促进，一则使脾气升，散精达肺，输布津液以止渴，二则使肾气固，封藏精微以生髓，且山药长肌肉坚强筋骨，治疗“消渴”并“骨痿”有标本兼治的效果。二者均是糖尿病合并骨质疏松的常用药物[4～6]，且现代药理研究[7]显示山药能通过调控Wnt和p38信号通路而具有抑制骨丢失作用，作为PPARγ的激动剂、AMPK激活剂而治疗2 型糖尿病[8]。黄芪甲苷通过调节PI3K/Akt/FoxO1通路抑制糖尿病大鼠肝糖异生[9-10]，黄芪多糖可直接促进成骨细胞质增殖、提高成骨细胞活性[11]，但二者配伍治疗T2DOP的作用机制却未见研究。本研究通过网络药理学研究的方法探讨黄芪和山药配伍治疗T2DOP的作用机制，为日后两者配伍治疗T2DOP研究提供方向。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1“山药-黄芪”药对化学成分：在中药系统药理数据库和分析平台(TCMSP, http://tcmspw.com/tcmsp.php)检索山药、黄芪对应的化学成分，筛选条件为口服生物利用度(oral bioavailability, OB)>30%且类药性(drug likeness, DL)>0.18。

1.1.2T2DOP疾病相关基因：以“Type 2 diabetic osteoporosis”为关键词，在Gene cards和 OMIM数据库中检索T2DOP相关基因，去除重复靶点，汇总得到与T2DOP相关的疾病靶点。

1.1.3“山药-黄芪”药对的活性成分靶标：在TCMSP(http://tcmspw.com/tcmsp.php)及Swiss Target Prediction(http://www.swisstargetprediction.ch)数据库中查询1.1.1中所得化学成分的预测靶标。并在Uniprot 数据库(https://www.uniprot.org)中将预测靶标转换为基因名，获得靶点的Uniprot ID。

1.2 方法

1.2.1构建“山药黄芪化学成分-山药黄芪候选靶标-T2DOP相关靶标”网络：利用Cytoscape 3.7.1软件构建“化学成分-预测靶标-T2DOP相关靶标”网络，利用 Cytoscape软件中Network Analyzer插件进行网络分析，并获取网络拓扑参数，筛选大于度中心性、接近中心性、中介中心性/中间中心性三者均值的节点。

1.2.2基因功能估计分析：将筛选节点中的靶标通过David 6.8数据库(https://david.ncifcrf.gov/)进行GO生物学富集分析，包括生物过程(biological process, BP)，分子功能(molecular function, MF)和细 胞 组 成(cellular component, CC)3 个部分，设定阈值P<0. 05，结果以气泡图形式进行可视化展示。

1.2.3KEGG富集分析及可视化：运用R语言软件对关键靶点进行信号通路富集分析，挑选与T2DOP相关的信号通路，最终设定阈值P<0. 05。

1.2.4“山药黄芪化学成分-关键作用靶点-信号通路”网络的构建：利用Cytoscape 3.7.1软件将1.2.1中得到的网络节点及1.2.3中富集的信号通路构成“山药黄芪化学成分-关键作用靶点-信号通路”网络，通过计算该网络的拓扑特征值，判断山药黄芪治疗T2DOP的关键化学成分、作用靶标及信号通路。

2 结果

2.1 “山药-黄芪”药对中活性组分的筛选

在TCMSP中查询到符合筛选条件的山药活性成分16 个、黄芪20 个，最终共筛选出36个化合物，见表1。

表1 “山药-黄芪”药对的候选活性成分信息

2.2 T2DOP疾病靶基因的筛选结果

在Gene cards网站收集得到T2DOP疾病靶标共3 180 个，OMIM网站收集得到183 个T2DOP靶标，合并2 个数据库数据，剔除重合基因，共检索出3 305 个相关基因信息。

2.3 “山药-黄芪”药对中活性成分的靶标预测

将筛选出的36 个成分分别在TCMSP平台和Swiss Target Prediction网站中查询预测的靶点，并通过Uniprot数据库将蛋白靶点转化为靶点基因，其中山药16 个成分，370 个靶基因；黄芪20 个成分，547 个靶基因，最终共有36 个化合物，去除重复靶基因后共698条靶基因信息。

2.4 “山药黄芪化学成分-山药黄芪候选靶基因-T2DOP相关靶基因”网络的构建

利用Cytoscape 3.7.1软件构建“山药黄芪化学成分-山药黄芪候选靶基因-T2DOP相关靶基因”网络，见图1。网络中各个节点之间相互作用，根据网络拓扑学结构分析结果，共512个节点，以大于该网络的度中心性均值7.286 0、接近中心性0.316 8、中介中心性/中间中心性均值0.004 1为筛选条件筛选出关键节点67 个，其中含有靶标40 个，MET，CYP19A1，AR，PTGS1，ADORA2A，PTGS2，CDK2，GSK3B，NCOA2，ESR2，KDR，ESR1，PTPN1，SRC，RXRA，EGFR，CASP3，GABRA1，CCNA2，PARP1，CA2，ALOX12，PGR，ADRB2，NOS2，PPARG，SYK，ABL1，MAPK14，CCNB1，BACE1共31 个靶标为T2DOP疾病靶基因，此外尚有ACHE、ADORA1、ADRA1B、CA14、CA9、CDK1、CHRM1、HSD17B2、MAOB 9 个关键靶标。

2.5 GO 功能分析结果

使用David 6.8数据库对山药黄芪治疗T2DOP的40 个关键靶点进行GO富集分析，筛选P<0.05的条目，共有87 个GO生物学条目，其中有56 个BP条目，21 个MF条目，10 个CC条目，生物过程包括肽基丝氨酸磷酸化、调节细胞增殖、跨膜受体蛋白酪氨酸激酶信号通路、视黄酸的反应、转录、ERK1和ERK2级联的正调控、子宫内胚胎发育、RNA聚合酶II启动子转录的正调控、炎症反应、凋亡过程的负调控等；分子功能涉及ATP结合、锌离子结合、类固醇激素受体活性、序列特异性DNA结合、碳酸盐脱水酶活性等。富集于细胞核、细胞膜、细胞溶质、细胞质核周区域、高尔基体、质膜胞质侧的外源成分、受体复合体、核染色质、细胞连接、RNA聚合酶II转录因子复合物等区域。见图2～图4。

图2 “山药-黄芪”抗T2DOP潜在靶点生物过程的GO分析前10 位

图3 山药-黄芪抗T2DOP潜在靶点分子功能的GO分析

图4 山药-黄芪抗T2DOP潜在靶点细胞组分的GO分析

2.6 KEGG信号通路富集分析与化合物-靶点-通路互相作用网络构建

利用R语言对40 个关键靶标基因进行KEGG 通路分析。在通路富集分析中，得到102条信号通路，其中与T2DOP相关的17 条通路，分别为VEGF信号通路(VEGF signaling pathway)、甲状腺素信号通路(thyroid hormone signaling pathway)、松弛素信号通路(relaxin signaling pathway)、雌激素信号通路(estrogen signaling pathway)、内分泌抵抗(endocrine resistance)、催乳素信号通路(prolactin signaling pathway)、细胞衰老(cellular senescence)、卵巢类固醇生成(ovarian steroidogenesis)、血小板活化(platelet activation)、黏着斑(focal adhesion)、FoxO信号通路(FoxO signaling pathway)、脂肪细胞中脂解的调节(regulation of lipolysis in adipocytes)、p53信号通路(p53 signaling pathway)、PI3K-Akt信号通路(PI3K-Akt signaling pathway)、钙信号通路(calcium signaling pathway)、IL-17信号通路(IL-17 signaling pathway)、花生四烯酸代谢(arachidonic acid metabolism)。见图5。

将筛选出的68 个节点及17 条T2DOP相关的KEGG通路导入Cytoseape软件构建“化合物-靶基因-信号通路”互相作用网络。利用Cytoscape 3.7.1软件构建“山药-黄芪”药对中化学成分所对应的靶点与通路，见图5。网络中各个节点之间相互作用，根据网络拓扑学结构分析结果，共84 个节点，该网络的度中心性均值26.928 6、接近中心性0.442 4、中介中心性/中间中心性均值0.015 8的2倍为筛选条件筛选出关键节点28 个，其中含有靶标15 个，均为T2DOP疾病靶基因，按度值排序为CDK2、PTGS2、PTGS1、GSK3B、SRC、CYP19A1、EGFR、ESR1、ESR2、AR、MAPK14、ADORA2A、NCOA2、KDR、NOS2；13 个节点为化合物，按度值排序依次为山奈酚、异鼠李素、槲皮素、(6aR,11aR)-3-羟基-9,10-二甲氧基紫檀烷、7-O-甲基异戊醇、3,9-di-O-美迪紫檀素、海风藤烯酮、芒柄花黄素、熊竹素、毛蕊异黄酮、异黄烷酮、荜茇明宁碱、(3R)-3-(2-hydroxy-3,4-dimethoxyphenyl)chroman-7-ol。文献研究表明，山奈酚[12-13 ]对2 型糖尿病及骨质疏松均有调节作用，槲皮素[14]具有降糖作用，异鼠李素[15]可能抑制经典NF-κB通路对破骨细胞的分化具有抑制作用, 毛蕊异黄酮、芒柄花黄素可通过调节骨形态发生蛋白2的表达促进成骨细胞的成骨作用[16]，说明山奈酚、异鼠李素、槲皮素等13 个化合物可能是山药黄芪药对发挥抗T2DOP的活性化合物。度值排前三位的信号通路分别为PI3K-Akt信号通路、钙信号通路及雌激素信号通路，说明这些信号通路在调节T2DOP中起关键作用。

图5 “山药-黄芪”药对治疗T2DOP的 KEGG 信号通路分析

图6 “山药-黄芪”药对中化学成分所对应的靶点与通路

3 讨论

2 型糖尿病(T2DM)是一种以缺乏胰岛素和高糖为特征的慢性代谢性疾病，占糖尿病患者的90%以上，可引起骨质疏松，导致T2DOP。T2DOP在T2DM并发症中病发率最高可达60%[17-18]，西医主要以对症治疗为主，然而糖尿病合并骨质疏松的发病机制比较复杂，早期症状不明显，部分降糖西药亦会影响到骨密度[19-20]，使其在防治中加大了难度。中医药作用的多靶点性在临床治疗复杂发病机制的T2DOP方面有一定的优势，网络药理学以生物学网络节点的连接和关系分析为基础构建“化学成分-预测靶标-信号通路”的多层次网络，然后综合分析中药复方的作用，既反映了中药复方多成分、多靶点、多通路的特点，又与疾病结合起来，与中医整体观、辨证论治的基本原则相吻合。

通过检索TCMSP 数据库，山药-黄芪药对中含有OB>30 %且DL>0.18 %的化学成分36个，经过进一步检索得到预测作用靶点698 个，T2DOP共得到3 305 个相关靶点，山药黄芪化学成分-山药黄芪候选靶基因与T2DOP相关靶标作用网络图中以大于该网络的度中心性、接近中心性、中介中心性/中间中心性均值为筛选条件筛选出关键节点67 个，其中含有靶标40 个。以40 个靶标进行GO分析及KEGG 通路分析，结果表明，GO分析中有56个BP条目，10 个CC条目，21 个MF条目，结果表明山药-黄芪药对主要调节肽基丝氨酸磷酸化、调节细胞增殖、跨膜受体蛋白酪氨酸激酶信号通路、视黄酸的反应、转录、ERK1和ERK2级联的正调控、子宫内胚胎发育、RNA聚合酶II启动子转录的正调控、炎症反应、凋亡过程的负调控等生物过程。通路富集分析表明，主要影响对糖尿病和骨质疏松均有调节作用的卵巢类固醇生成及雌激素信号通路、糖尿病相关信号通路(松弛素信号通路、黏着斑、催乳素信号通路、甲状腺素信号通路、内分泌抵抗、血小板活化[21]、FoxO信号通路[22])、与骨质疏松成骨作用相关的作用通路(脂肪细胞中脂解的调节、VEGF信号通路、p53信号通路、IL-17信号通路)、与骨质疏松破骨作用相关的信号通路(钙信号通路、细胞衰老、花生四烯酸代谢)、与骨质疏松骨成骨作用破骨作用均具有调节作用的PI3K-Akt信号通路[23-24]等。

这与文献调研[25]不谋而合，雌激素可通过胰岛β细胞中的雌激素受体促进胰岛细胞存活，脂质稳态和胰岛素的生物合成和分泌；雌激素同时是骨骼代谢的主要激素调节剂，雌激素缺乏会增强骨吸收，导致骨重建失衡，还可促进骨形成，提高骨密度，对糖尿病及骨质疏松均具有较好的调节作用。糖尿病从多方面影响骨的形成以及骨吸收过程，诱发骨质疏松，因此，干预糖尿病的发展可减缓骨质疏松的发展。研究报道，松弛素信号通路[26]、黏着斑[27]、催乳素信号通路[28]、甲状腺素信号通路[29]对糖尿病均具有调节作用。骨代谢的稳态取决于成骨细胞诱导的骨形成和破骨细胞诱导的骨吸收之间的平衡。糖尿病性骨质疏松主要是由于成骨细胞和破骨细胞之间的不平衡导致骨形成减少，骨密度和骨强度受损，以及骨微结构的破坏。强化和恢复成骨细胞的成骨分化，重新平衡成骨细胞和破骨细胞的数量，可能有助于治疗糖尿病性骨质疏松症，如双歧曲霉多糖引起抗骨质疏松作用的机制是由VEGF和OPG的上调介导的[30]；p53抑制成骨细胞增殖并增强成骨细胞凋亡，从而减少骨形成[31]；IL-17在骨质流失中起重要作用，IL-17促进了骨形成负调节剂硬化蛋白基因诱导的脂肪形成，并增强了对成骨的抑制作用[32]；NFATc1是破骨细胞分化的主要转录因子，可调控许多破骨细胞的特异功能基因，RANKL激活钙信号通路，是激活NFATc1所必需的[33]；说明VEGF信号通路、p53信号通路、IL-17信号通路等主要影响成骨作用，钙信号通路等主要调节破骨细胞的功能。

综上所述，本文采用网络药理学的分析方法探讨山药-黄芪药对治疗T2DOP的可能作用靶标及途径，并建立“山药黄芪药对化学成分-靶标基因-信号通路”相互作用网络图，揭示了山药黄芪药对治疗T2DOP的多维调控网络，其中起主要作用的化学成分可能为山奈酚、异鼠李素、槲皮素、(6aR,11aR)-3-羟基-9,10-二甲氧基紫檀烷、7-O-甲基异戊醇、3,9-di-O-美迪紫檀素、海风藤烯酮、芒柄花黄素、熊竹素、毛蕊异黄酮、异黄烷酮、荜茇明宁碱、(3R)-3-(2-hydroxy-3,4-dimethoxyphenyl)chroman-7-ol 共13 个化合物，山药黄芪药对治疗T2DOP的靶标可能主要为CDK2、PTGS2、PTGS1、GSK3B、SRC、CYP19A1、EGFR、ESR1、ESR2、AR、MAPK14、ADORA2A、NCOA2、KDR、NOS2 共15 个靶标，度值相对较高的信号通路为PI3K-Akt信号通路、钙信号通路及雌激素信号通路，最终达到调节T2DOP的作用。