五味子酒对小鼠睡眠及记忆功能的影响

王 梓，梁俊彬，侯 强，虞 霄，刘一州，宋春梅，刘 敏

(吉林医药学院公共卫生学院，吉林 吉林 132013)

失眠症是现今社会的普遍现象,它不仅会影响人们夜间的休息,还会导致记忆力下降，严重影响到白天的正常工作与生活[1]。五味子按照产地分为北五味子和南五味子。北五味子的外形多呈肾形，有油亮光泽，表皮较为薄而脆，果肉可闻到微香，入口味酸，它具有改善血液循环、止咳化痰、降低血压、保护心脏和肝脏的作用[2-3]。研究发现：五味子中的黄酮化合物和五味子素等具有广泛抑制中枢神经活动的作用，同时还具有安神的作用[4-5]。本研究探讨五味子酒对小鼠的睡眠以及记忆方面是否具有改善作用，为五味子酒的开发应用提供科学依据[6]。

1 材料与方法

1.1 实验材料

五味子产地为吉林。雄性昆明小鼠，体重25～30 g，由吉林大学基础医学院实验动物中心提供，适应性饲养1周后进行实验。

荧光分光光度计(960CRT上海精密科学仪器有限公司)；粉碎机(SF-130B泰州市精密科学有限公司)；旋转蒸发仪(RE-5220上海亚荣仪器有限公司)；Morris水迷宫(XR-XM101-X1上海欣软仪器设备有限公司)。

多巴胺(DA)、五羟色胺(5-HT)、五羟吲哚乙酸(5-HIAA)ELISA试剂盒，均购自武汉博士德生物工程有限公司。

1.2 五味子酒的制备及成分测定

称取新鲜五味子1.5 kg、单晶冰糖1 kg与双蒸水6 L混合28 ℃发酵一个月。酒精计测定酒精度(20 ℃)为(10.06±0.26)%(v/v)；糖度计测定糖度为(250.8±0.5)g/L。亚硝酸钠-硝酸铝法测定主要活性成为分水溶性黄酮，含量为(41.0±3.5)g/L。使用前用生理盐水稀释到所需浓度。

1.3 小鼠的分组以及给药

50只健康成年雄性昆明小鼠随机分成5组，分别为空白对照组(生理盐水)，阳性对照组(地西泮2.5 mg/kg)，五味子酒低、中、高剂量组(五味子酒6.25、12.5、25 mg/kg)。每组10只，灌胃量10 mL/kg[6]。分组后给予对应的受试物，阳性对照组在最后1天一次性给予2.5 mg/kg的地西泮，其他组连续灌胃30 d。

1.4 睡眠实验

1.4.1直接睡眠实验

末次给药后将小鼠轻轻放置于背卧位，观察其翻正反射是否消失。翻正反射以小鼠置于背卧位60 s不翻转为标准。如果消失，记录其睡眠时间以及入睡的小鼠数量[7]。

1.4.2戊巴比妥钠阈下剂量催眠试验

末次给药30 min后各组小鼠腹腔注射戊巴比妥钠40 mg/kg，注射量为10 mL/kg，观察30 min以内的小鼠睡眠情况，以翻正反射消失60 s为标准，记录小鼠入睡的数量，计算小鼠睡眠发生率[8]。

1.4.3延长戊巴比妥钠睡眠时间试验

末次给药30 min后各组小鼠腹腔注射戊巴比妥钠60 mg/kg，注射量为10 mL/kg，使小鼠背卧位置，翻正反射消失60 s为标准，记录各组小鼠睡眠潜伏期以及睡眠时间[9]。

1.5 小鼠记忆实验

Morris水迷宫实验检测小鼠的记忆能力，水温(22±1)℃，实验室密封，保证水池水面上没有光影。

1.5.1定位航行实验

实验进行4 d，每天进行4次，每次1 min。实验前1天将小鼠放入水迷宫中自由适应2 min。实验开始时将平台至于水迷宫东北象限，小鼠依次从池壁四个象限放入水中，记录其寻找到平台并保持15 s的潜伏期。如果1 min内没有找到平台就将其引导至平台，并保持15 s，潜伏期记录为60 s。记录4 d小鼠的逃避潜伏期并计算其平均值。

1.5.2空间探索实验

于定位航行实验结束后的次日进行。将东北角平台移除，将小鼠依次放入水迷宫，记录小鼠在东北象限的停留时间以及穿越平台位置的次数[10]。

1.6 小鼠脑中三种神经递质的检测

实验结束后将小鼠断头处死，立即取脑组织400 mg，放入匀浆管中并加入10倍体积冰的酸性正丁醇匀浆，按照ELISA试剂盒说明书按步骤检测DA、5-HT、5-HIAA的含量[11]。

2 结 果

2.1 小鼠睡眠实验

各组小鼠连续灌胃30 d，直接睡眠实验时，翻正反射仍然存在，入睡小鼠数量为0，没有发生直接睡眠的状况发生，说明了五味子酒对于小鼠没有直接的睡眠影响。

戊巴比妥钠阈下剂量催眠试验中空白对照组，阳性对照组，五味子酒低、中、高剂量组小鼠入睡数分别为1、9、7、7、8只，各组与空白对照组比较，差异均有统计学意义(P<0.05)，说明五味子酒对小鼠睡眠有影响。

在延长戊巴比妥钠睡眠持续期实验中，从注射戊巴比妥钠到翻正反射消失的时间为睡眠潜伏期，翻正反射消失到翻正反射恢复的时间为睡眠持续期。由表1可以看出，与空白对照组比较，各组小鼠的睡眠潜伏期都缩短，睡眠持续期都延长。其中，阳性对照组，五味子酒中、高剂量组具有统计学意义(P<0.01)。说明五味子酒能延长戊巴比妥钠致小鼠睡眠持续期。

表1 小鼠睡眠潜伏期与睡眠持续期

2.2 小鼠记忆实验结果

2.2.1定位航行实验

由表2可见，在定位航行实验中，小鼠对周围环境有个熟悉辨认的过程，所有分组第一天到第四天逃避潜伏期依次缩短，其中高剂量组逃避潜伏期与空白对照组逃避潜伏期差异有统计学意义(P<0.05)。且低、中、高三个剂量组的逃避潜伏期依次缩短。实验结果表明，五味子酒对小鼠记忆有改善作用。

表2 小鼠逃避潜伏期

2.2.2空间探索实验

由表3可见，与空白对照组相比较，各剂量组小鼠穿越平台的次数有统计学意义(P<0.05或P<0.01)，穿越平台的次数是依次增加的。与空白对照组比较，中、高剂量组小鼠在东北象限停留的时间也具有统计学意义(P<0.05或P<0.01)。结合定位航行实验可以证明，五味子酒水提液对小鼠记忆具有改善功能，且高剂量组更为明显。

2.3 神经递质检测结果

由表4可以看出，与空白对照组相比较，五味子酒各剂量组脑组织中DA含量随着剂量增加而增加，但没有统计学意义；脑组织中5-HT和5-HIAA含量随着五味子酒的剂量增加而增加，在高剂量组差异具有统计学意义。

3 讨 论

五味子的主要有效成分为木脂素类和黄酮类，具有广泛的中枢神经活动抑制功能，并且具有安定神经系统兴奋性的作用和特点[12]。目前关于五味子类保健食品开发较少。本研究探讨五味子酒改善睡眠和记忆的功效。研究通过睡眠实验验证了五味子酒对于睡眠状况的改善情况，而睡眠质量和记忆能力紧密相关;通过Morris水迷宫实验来判断五味子酒对于小鼠记忆的影响，该实验是目前世界公认的较为客观的学习记忆功能的评价方法[13]。神经递质DA和睡眠与觉醒有关的神经结构有关联。当小鼠脑内DA浓度升高时，其脑电波出现兴奋的表现，睡眠困难；DA浓度降低时，小鼠睡眠困难减轻[14]。神经递质5-HT是参与睡眠与觉醒机制公认的经典神经递质之一，对于睡眠的发生和维持起着及其重要的作用，目前被认为是小鼠脑内的“致眠因子”；反之，5-HT浓度降低是引起小鼠失眠发生的重要指标之一。神经递质5-HIAA是小鼠脑内5-HT的主要代谢产物。5-HIAA浓度的增加，直接表明5-HT的合成和代谢的增加，促进小鼠睡眠发生[14]。本实验研究结果提示，五味子酒通过提高小鼠脑中5-HT和5-HIAA的含量进而促进小鼠睡眠发生，提高小鼠记忆水平。

表3 小鼠空间探索实验

表4 小鼠脑组织中神经递质含量