沂蒙草鸡J亚群禽白血病病毒分离鉴定及遗传变异分析

牛建蕊 ， 王 静 ， 王培坤 ， 薛 聪 ， 韩照清 ， 于 洋 ， 王 媛 ， 张兴林

(1. 临沂大学微生物与宿主健康研究所 ， 山东 临沂 276005 ； 2.临沂市兰山区畜牧发展促进中心 ， 山东 临沂 276005)

禽白血病(Avian leukosis,AL)是由禽白血病病毒(Avian leukosis virus,ALV)引起的以肿瘤发生和免疫抑制为特征的禽类疾病[1]。AL感染鸡的有A～E、J和K共7个亚群[2]，其中J亚群(Subgroup J of ALV,ALV-J)为感染鸡的主要外源性病毒，B、C、D亚群在临床上少见[3]，E亚群为内源性病毒，不具有致瘤性[4]。ALV-J于1988年在英国白羽肉鸡中首次发现，随后在全球范围内的广泛传播，给养禽业造成巨大经济损失[5]。杜岩等[6]于20世纪末，首次报道在中国商品代白羽肉鸡分离到ALV-J，ALV-J随后在我国各品种鸡群中广泛传播，给我国养禽业带来巨大经济损失[7-8]。

目前尚无有效商业化疫苗和药物可以防控AL，种群净化是控制该病有效的方式。我国部分大型育种公司开展实施的ALV净化工作效果显著。然而在地方品种鸡群，ALV感染鸡群情况仍然较为多发[9]。沂蒙草鸡是沂蒙山地区野外放养的本地柴鸡，品种优良，深受消费者喜爱，养殖规模逐年扩大。2020年上半年，部分养殖户反映在饲养过程中有部分鸡只出现内脏肿瘤死亡。为了确诊这些病例，同时了解沂蒙草鸡ALV感染情况，本试验针对沂蒙草鸡开展禽白血病流行病学调查。从沂蒙草鸡养殖场禽白血病病毒p27抗原阳性鸡中分离、鉴定出1株ALV-J，并完成了全基因序列测定及遗传变异分析，为沂蒙地区禽白血病防控提供一定科学依据。

1 材料与方法

1.1 样品与细胞 从沂蒙地区2个规模较大的沂蒙草鸡养殖场，分别各采集母鸡血浆46份，公鸡血浆46份，共184份样品。DF-1细胞由临沂大学微生物与宿主健康研究所保存。

1.2 主要试剂 ALV-p27 抗原检测试剂盒，购自北京天之泰生物科技有限公司；组织DNA抽提试剂盒购、凝胶回收试剂盒，均购自天根生化科技(北京)有限公司；2×Phanta Max Master Mix 高保真酶、PCR buffer (含Mg2+) ，均购自南京诺唯赞生物科技有限公司；DH5α大肠杆菌感受态细胞、pMD18-T载体，均购自宝生物工程(大连)有限公司。

1.3 病毒分离 按照文献[3]步骤将样品接种DF-1 细胞做病毒分离，9 d后收集细胞培养物。

1.4 细胞培养物ELISA检测 按照ALV-p27 抗原ELISA检测试剂盒说明书操作，检测细胞培养物中是否含有ALV-p27抗原。

1.5 PCR分型鉴定 鉴定出ALV-p27抗原阳性样品，重新进行病毒增殖培养并收集细胞培养物。按照DNA抽提试剂盒说明书，抽提细胞培养物中DNA，并分别用ALV各亚群鉴定引物进行鉴定。分型鉴定引物参照文献[3]设计并由华大基因科技服务有限公司合成，引物名称及序列以及目的片段大小见表1。

表1 本试验所用的引物Table 1 The primers used in this study

1.6 ALV-J全基因组序列测定 参照ALV-J原型株HPRS-103前病毒基因组序列，设计3对互相重叠的特异性引物，如表1所示。以鉴定为ALV-J阳性的病毒DNA为模板进行PCR扩增[1]。PCR产物经过1%琼脂糖凝胶电泳后回收、纯化，随后将纯化产物连接至pMD-18T载体，转化DH5α大肠杆菌感受态细胞，菌液PCR鉴定阳性后，每个片段挑选3个阳性质粒送华大基因科技服务有限公司测序。

1.7 序列分析 利用DNASTAR(Ver 7.1.0)对测序结果进行拼接进而获得完整病毒序列，对相应基因进行相似性比较分析。MEGA X(Ver 10.1.7)将获得全基因组序列与参考序列进行比较分析，利用最大似然法(Maximum likelihood method)构建系统发育树。利用在线软件Soft Berry(http：//linux1.softberry.com/berry.html)的NSITE分析工具进行转录调控元件分析。

2 结果

2.1 细胞培养物ALV-p27抗原ELISA检测 对收集的184份细胞培养物进行ALV-p27抗原检测，结果显示，有5份样品为阳性，阳性率为2.71%(图1)。

图1 样品ELISA检测结果Fig.1 ELISA results of the samples

2.2 阳性样品PCR检测 阳性样品进行亚群鉴定，结果表明，有4份样品在692 bp有特异性条带，1份样品在545 bp处有特异性条带(图2)。分别与ALV-A和ALV-J鉴定引物预期片段大小一致，表明4份为ALV-A，1份为ALV-J。将鉴定出的ALV-J毒株命名为SDLYU1901。

图2 样品PCR检测结果Fig.2 PCR results of the samplesM: DNA标准DL2 000； 1: 阴性对照； 2～6: 阳性样本M: DNA marker DL2 000; 1: Negative control; 2- 6: Positive sample

2.3 ALV-J分离株全基因组序列分析 分离株的前病毒基因组全长为7 640 bp。主要结构基因gag、pol、gp85和gp37基因长度分别为2 106、2 622、921 bp和591 bp，3′UTR长度为678 bp，3′LTR长度为326 bp。SDLYU1901与J亚群参考株全基因组相似性在93.1%～96.4%，其中与分离株JS09GY3相似性最高为96.4%，与其他亚群参考株相似性为83.0%～84.4%(表2)。系统进化分析结果显示，SDLYU1901与2009年江苏蛋鸡分离株JS09G3、JSO9GY6处于同一个分枝(图3)。

表2 分离株SDLYU1901 相似性分析Table 2 Similarity analysis of SDLYU1901 (%)

图3 基于SDLYU1901 全基因系统进化树Fig.3 Phylogenetic tree of whole genome of SDLYU1901•： 本试验分离株; 下同•： Strain isolated in this test. The same as below

2.4 分离株env基因序列分析 ALV的env基因是病毒致肿瘤类型的关键基因，该基因编码决定病毒亚群特异性的gp85 表面蛋白以及 gp37 跨膜蛋白[10]。正是env基因的差异，导致了 ALV-J的致病性、致瘤性普遍强于其他亚群病毒[11]。对沂蒙草鸡分离株SDLYU1901gp85基因分析，结果显示，gp85基因与分离株GX15MM6-2亲缘关系较近(图4A)，核苷酸相似性为95.4%，氨基酸相似性为92.8%。对SDLYU1901gp37基因分析，结果显示，gp37基因与分离株SCDY-1亲缘关系较近(图4B)，核苷酸相似性为97.0%，氨基酸相似性为96.4%。

图4 基于分离株SDLYU1901 gp 85基因(A)和gp 37基因(B)进化树Fig.4 Phylogenetic tree of gp 85 gene (A) and gp 37 gene (B) of SDLYU1901

2.5 分离株3′UTR序列分析 3′UTR由rTM(redundant TM)、单拷贝正向重复单位(Direct repeat，DR1)和 E 元件(XSR)构成[12]。不同ALV-J毒株3′UTR 区域突变程度不同。SDLYU1901 在3′UTR缺失主要发生在rTM和DR1区域，包括rTM区域的175 bp以及DR1区域的30 bp，共有205 bp的缺失。分离株E元件未发现缺失。见图5。

图5 ALV-J分离株与参考毒株3′UTR基因序列分析Fig.5 Gene sequence analysis of 3′UTR of ALV-J isolated strain and references strains

2.6 分离株3′LTR序列分析 LTR序列由高度保守的R区和U5区，以及含有较多转录调控元件U3区构成[13]。对分离株U3区序列分析，结果显示，其与ALV-J原型株HPRS-103相似性最高，为97.3%。对分离株SDLYU1901的U3区进行转录元件分析，结果显示，其转录元件与原型株HPRS-103高度一致，包含有C/EBP、E2BP、NFAP-1、AIB REP1、TATA box、2个Y box、2个PRE box、2个CArG box等转录调控元件。见图6。

图6 不同ALV-J 分离株U3区对比分析Fig.6 Comparative analysis of the U3 region of different ALV-J strains

3 讨论

自1999年我国首次报道从肉鸡中分离到ALV-J至今20余年间，其给我国养禽业带来巨大经济损失[14]。2008年开始的禽白血病净化工作取得了显著成效[15]。然而自2018年开始，我国鸡群感染禽白血病的报道明显增多，禽白血病在我国部分地区有重新流行趋势[2,9]。本试验对沂蒙地区2个规模较大的沂蒙草鸡养殖场开展禽白血病感染情况调查，从184份血浆样品中分离到5份ALV阳性样品，经过分型引物鉴定有4份样品为ALV-A，1份样品为ALV-J，表明沂蒙草鸡鸡群存在ALV感染。

对分离到的ALV-J毒株SDLYU1901进行了全基因组序列测定及分析。结果显示，分离株与JS09GY3及JS09GY6亲缘关系最近，表明它们有着共同来源。对毒株结构基因进行分析，结果显示，gag和pol相对较为保守，与J亚群其他毒株相比，氨基酸变异频率在5%以内，而env基因变异频率较高。研究表明，env基因决定病毒的致瘤谱及宿主范围，特别是gp85基因的hr1、hr2以及Vr3等区域[16]。本试验分离毒株gp85基因与广西三黄鸡分离株GX15MM6-2亲缘关系最近，gp37基因与四川分离株SCDY-1亲缘关系较近，这提示分离株或许是不同宿主来源分离株的重组毒株，而这种可能的重组毒株是否会导致临床症状和肿瘤变异需要进一步研究。

LTR区的 U3区含有转录启动子和增强子等转录调控元件，与病毒毒力、转录水平和复制能力等密切相关[17]。本试验分离株SDLYU1901的LTR的U3序列与原型株HPRS-103相似性最高，为97.3%，高度保守。3′UTR与ALV的表达调控，复制动力学密切相关[12]。作者前期对1988—2018年分离的85株ALV-J全基因的3′UTR序列进行分析，发现85株ALV-J分离毒株中有84.71%毒株在3′UTR区域存在1个205 bp(175 bp位于rTM，30 bp 位于DR-1)的缺失[1]，而且该缺失已经被证实有利于病毒复制，增强蛋鸡和肉鸡的致病性[18]。本试验中分离株SDLYU1901在3′UTR存在一个同样的缺失。作者前期试验发现，在85株ALV-J中有30.59%(26/85)存在E原件缺失[1]，而这些毒株主要分离自白羽肉鸡和黄羽肉鸡，且2014年后分离毒株未发现该缺失继续出现。本试验分离株SDLYU1901的E元件也未发生缺失。

本试验对沂蒙地区沂蒙草鸡禽白血病感染情况进行调查，并对分离到的1株ALV-J完成了全基因组序列测定及分析。本试验结果表明，沂蒙草鸡存在ALV不同亚群感染，而且分离到的ALV-J毒株可能是由早些年不同宿主遗传背景分离株重组产生的，该病毒致病性及其对本地鸡群影响尚不清楚，需要进一步研究。本试验调查结果对下一步开展禽白血病净化工作有重要指导意义，同时探究的ALV-J 毒株来源及变异情况，对研究病毒溯源有指导意义。