不同来源耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的耐药调查与优势基因型分析

许弘仪 ， 辛宇航 ， 刘 娜 ， 张青青 ， 王 娟 ， 李月华 ， 黄秀梅 ， 王龙光 ， 曲志娜 ， 刘焕奇

(1. 青岛农业大学动物医学院 ， 山东 青岛 266109 ； 2. 中国动物卫生与流行病学中心 ， 山东 青岛 266032)

金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus,S.aureus)是一种常见的致病菌，广泛存在于自然界，可以引起人和动物多种疾病。随着药物滥用和用药不规范，耐药菌株日益出现，其中耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(Methicillin-resistantStaphylococcusaureus,MRSA)的出现，不仅给养殖业带来损失，在人类疾病的治疗中也带来了巨大的困难，其引起的脓毒血症、菌血症等全身感染疾病发病率居高不下，并且病死率超出非MRSA感染病例。近年来，多项研究表明，动物源MRSA，尤其是猪源MRSA检出率逐渐增高，多篇报道证实，欧美地区的主要流行型别ST 398能够引起人的临床感染[1]，亚洲地区流行的ST 9也从养殖场工作人员分离得到，这说明同一基因型已经能够通过养殖、屠宰和消费等环节向人类传播。因此，本研究对来自10个省份3种动物源4 755份样品进行分离鉴定，对筛选出的239株MRSA进行MLST分型试验和药敏试验，分析不同来源MRSA的流行分布、耐药特征与优势基因型，探讨基因型与耐药表型的相关关系，为临床合理用药、有效控制MRSA的流行传播提供依据。

1 材料与方法

1.1 主要试剂和仪器 7.5%氯化钠肉汤、金黄色葡萄球菌显色培养基、胰蛋白胨大豆肉汤、细菌琼脂粉，均购自北京陆桥技术股份有限公司；GoTaq Green MasterMix酶、DNA marker DL1 000，均购自TaKaRa公司；96孔药敏板，购自上海星佰生物技术有限公司。生物安全柜、恒温培养箱、分光光度计、比浊仪、PCR仪、电泳仪、XR凝胶成像分析仪、快速涡匀器等，均由本实验室提供。

1.2 样品来源与质控菌株 4 755份样品，自2015年4月—2017年9月从湖北、江西、山东、河南等10个省份采集获得，其中猪鼻腔拭子3 119份、牛鼻腔拭子895份、鸡咽拭子741份；质控菌株为金黄色葡萄球菌ATCC 29213，由中国动物卫生与流行病学中心致病微生物监测室提供。

1.3 方法

1.3.1 金黄色葡萄球菌的分离 将样品置入7.5%氯化钠肉汤，37 ℃增菌8～18 h后，接种于金黄色葡萄球菌显色培养基，37 ℃培养18～24 h，挑取疑似菌落再次接种显色培养基，重复3～4次，同时以金黄色葡萄球菌(ATCC 29213)为阳性对照。

1.3.2 金黄色葡萄球菌与MRSA的鉴定 采用煮沸法提取菌株DNA作为模板，根据参考文献[2]设计16S rRNA、nuc和mecA引物序列，用PCR法进行扩增，反应条件：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性30 s，55 ℃ 退火30 s，72 ℃延伸1 min，循环30次；72 ℃延伸5 min。扩增产物用1.3%的琼脂糖凝胶进行水平电泳，观察结果，同时扩增出16S rRNA、nuc条带的菌株为金黄色葡萄球菌，同时扩增出16S rRNA、nuc、mecA条带的菌株为MRSA。

1.3.3 药敏试验 采用微量肉汤稀释法测定MRSA的药物敏感性，记录试验菌株的最小抑菌浓度。根据96孔药敏板说明书接种菌液后，将药敏板放置于37 ℃恒温箱中，孵育16～24 h后在质控菌株ATCC 29213的最低抑菌浓度满足要求的前提下进行结果判读。试验菌的结果用敏感(S)、中介(I)和耐药(R)报告，对3类及3类以上抗菌药物同时耐药的菌株记为多重耐药菌。

1.3.4 多位点序列分型(MLST) 选取7对管家基因arcC、aroE、glpF、gmK、pta、tpi、yqiL，按参考文献[2]设计相应引物，进行PCR扩增，反应条件：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性45 s，55 ℃退火1 min，72 ℃ 延伸1 min，循环30次；72 ℃延伸5 min。PCR扩增产物送擎科生物公司进行双向测序，测序结果与标准序列进行对比并剪切后，输入PubMLST网站查询每个等位基因的序号，由7个序号确定菌株的ST型。

1.3.5 数据处理与分析 将所有菌株的耐药谱和分型信息等录入BioNumerics 7.6软件，构建最小生成树和聚类分析，探讨不同ST型别菌株间的亲缘关系。

2 结果

2.1 不同来源及不同地区菌株分布情况 共采集4 755份样品，分离获得1 442株金黄色葡萄球菌，包括239株MRSA，见表1。其中猪源样品共检出1 081株 (34.66%)金黄色葡萄球菌，包括203株(18.78%)MRSA；牛源样品共检出187株(20.89%)金黄色葡萄球菌，包括27株(14.44%)MRSA，其中23株来自河北省，山东省未检出牛源MRSA；鸡源样品共检出174株(23.48%)金黄色葡萄球菌，包括9株(5.17%)MRSA，全部来自山东省。

表1 各省份金黄色葡萄球菌和MRSA检出率Table 1 Isolation rate of S.aureus and MRSA in different province

2.2 耐药结果与分析 各省MRSA菌株对17种药物均有不同程度的耐药(表2)，其中山东省猪源MRSA检出数量过多，仅挑选11株进行药敏试验。

由表2可知，猪源MRSA除对磺胺异噁唑和复方新诺明较为敏感，对其余药物耐药率均在20%～82%，对氟喹诺酮类药物耐药最为严重。各省猪源MRSA耐药率差异明显，重庆、山东、广西壮族自治区(以下简称广西)、广州、河北菌株耐药情况严重，对青霉素、苯唑西林、头孢菌素、克林霉素和喹诺酮类药物的耐药率普遍在80%以上，部分省份达到100%；湖北、河南、江西、黑龙江、陕西仅检测出对恩诺沙星、氧氟沙星和利奈唑胺有较高的耐药率，江西和河南仅检测出对苯唑西林、头孢噻呋和庆大霉素的耐药率，分别分布在15%～55%不等。

河北省牛源MRSA对青霉素、红霉素、克林霉素和头孢类药物耐药率100%，未检测到恩诺沙星和利奈唑胺等药物的耐药菌株；广西菌株未检测到磺胺异噁唑和利奈唑胺耐药菌株。山东鸡源MRSA耐药情况严重，对多数药物耐药率为100%，仅对磺胺异噁唑、复方新诺明、氟苯尼考和利奈唑胺敏感。

2.3 多重耐药情况 重庆、山东、广西、黑龙江和广州猪源MRSA全部为多重耐药菌株，多数为8～10耐；湖北、河南、江西等地多重耐药率在30%～80%不等，主要为1～4耐。牛源和鸡源MRSA全部为多重耐药菌株，分别集中在4～7耐和9～11耐。

2.4 MLST分型 来自10个省的179株MRSA共分为4个ST型(表3)，ST 9为优势型别，在3种动物源中都有分布，其次是ST 59，分布在猪源和牛源，ST 398和ST 1376仅出现在猪源。

表3 不同来源MRSA分离菌株的MLST分型结果Table 3 MLST results of MRSA isolated from different sources (株)

由封二彩版图1可知，143株猪源MRSA共分为4个序列型，其中ST 9为优势型别，其次是ST 398、ST 1376和ST 59。ST 9在除陕西和河北之外的8个省中均有检出，ST 398在重庆、河南和山东检出，ST 1376在湖北和陕西检出，ST 59在重庆和河北检出；牛源MRSA分为2个序列型，ST 9和ST 59；鸡源菌株全部为ST 9。

图1 不同地区猪源MRSA遗传最小生成树Fig.1 Genetic minimum spanning tree of swine MRSA isolated from different sourcesC：重庆； D：山东； E：广西； F：河北； G：广州； H：江西； I：河南； J：湖北； K：黑龙江； L：陕西C:Chongqing; D:Shandong; E:Guangxi; F:Hebei; G:Guangzhou; H:Jiangxi; I:Henan; J:Hubei; K:Heilongjiang; L:Shaanxi

2.5 聚类分析 由图2可知，ST 9和ST 1376的亲缘关系在85%左右，ST 398和ST 9、ST 1376的亲缘关系仅在15%，ST 59与其余3种型别无亲缘关系。来自8个省份的123株猪源ST 9型菌株共产生46种耐药谱，分别来自重庆和河北的ST 59型菌株，产生的耐药谱相同。以上结果表明，ST型、分布地区和耐药表型之间并没有具体相关性。

图2 不同来源MRSA聚类分析Fig.2 MRSA clustering analysis diagra

3 讨论

本试验分离的239株MRSA分别来自10个省份和3种动物源，其中猪源样品来自10个省份的养殖场，具有广泛的代表性。2018年李淑敏等[4]对河南等6个省份的480份猪鼻腔拭子进行鉴定，结果分离到104株金黄色葡萄球菌，其中36株为MRSA，检出率为34.6%，高于本文的研究结果(18.78%)。目前，国内各省份猪源MRSA检出率已报道的有黑龙江6.4%[5]、湖北12.1%[6]、河南33.2%[6]、四川33.67%[7]、上海54.22%[8]、陕西8.5%[9]、河北25%[9]，与本文结果相比存在差异的原因可能与样品类型和地区有关，本试验涉及的猪源样品全部为鼻腔拭子，而其他研究者选择的样品类型还包括了畜舍环境、器具等，这使得分离率出现差异。

将山东、河北和广西三地采集的动物源样品进行对比发现，猪源样品中MRSA分离率山东远高于另外2个省；牛源样品中虽然山东和广西金黄色葡萄球菌检出率较高，但MRSA检出率远低于河北(74.19%)，这可能是因为河北地区样品采集较为集中，仅局限在几个养殖场内，采集范围不够广泛，并且采集的样品为鼻腔拭子，并非牛奶样品。

本试验结果显示，143株猪源MRSA对检测的17种药物都有不同程度的耐药，除河北省外，其余地区全部对恩诺沙星耐药，并且耐药率多数在80%以上；重庆、山东、广西、广州和河北地区菌株对青霉素耐药率高达100%，其余仅对利奈唑胺和磺胺类药物敏感，与Cui等[9]和张强等[10]的研究结果一致。

牛源MRSA多重耐药率达到100%，但耐药情况与猪源相比较轻，对磺胺类药物较为敏感，并且未检测到利奈唑胺耐药菌株；鸡源菌株除了对磺胺异噁唑和利奈唑胺较为敏感外，对其余大部分药物均有较高耐药率，这是因为不同动物用药不同，产生的耐药谱也有所差异，但对临床常用的青霉素类药物普遍有较高的耐药率。

据报道，欧美国家猪源MRSA主要流行株是ST 398[11-13]，亚洲地区是ST 9，本文猪源MRSA的MLST分型中，除陕西和河北外的地区优势型别均为ST 9。2009年Wagenaar等[14]在四川等地区部分猪场圈舍尘土中分离到MRSA,优势克隆为ST 9,也存在其变异体ST 1376；同年，Yan等[5]在黑龙江2个屠宰场猪鼻腔拭子中分离到MRSA，以ST 398为主，其次为ST 9，与本文试验结果一致。本文27株牛源MRSA中，来自广西的4株均为ST 9，河北的23株均为ST 59，与猪源结果相同。Kong等[15]2018年对医院临床分离MRSA进行MLST分型试验发现，ST 59分离率达到28.9%，结合本试验结果推测ST 59的基因型不仅存在区域性流行的特点，还能够在不同动物之间进行传播。在人医方面，国内外研究结果显示，多种ST型菌株均能感染人类，其中ST 239和ST 5占比较大[16-17]。从上述结果可以看出，一种的ST型能够同时感染动物和人，但不同物种间的主要流行型别存在较大差异。

本试验发现，MRSA的ST型与耐药表型并无具体相关性，相同ST型菌株出现类似或相同耐药谱仅发生在同一养殖场来源的菌株，由此推断，决定耐药谱的原因主要是养殖方式与用药习惯。但比起国内分布广泛的ST 9和其变体ST 1376、ST 59和ST 398的多重耐药情况明显较轻。

综上所述，各地MRSA均有较高的检出率，并且基因型已出现国内流行型ST 9的变体ST 1376。MRSA耐药率和多重耐药性均处于较高水平，无论是对于养殖业还是人医临床都是巨大的影响。MRSA能够在不同物种之间传播，大大增加了人通过食用动物源食品感染的风险，这又给MRSA的防控增加了难题。因此,在生产养殖过程中应合理规范使用抗生素,加强特殊耐药表型菌株的监测，及时掌握其流行分布特征，为其有效防控提供依据。