紫前款甘散的质量标准研究

康诵垚 ， 杨 钊 ， 王春元 ， 杨芬芳 ， 郝智慧

(1.青岛农业大学病原微生物与新药创制实验室 ， 山东 青岛 266000 ； 2.青岛市食品药品检验研究院 ， 山东 青岛 266071 ； 3.中国农业大学中兽医药创新中心 ， 北京 海淀 100193)

紫前款甘散是根据临床验方开发研制而成的一种中药复方散剂，本方以紫菀、前胡、款冬花、甘草、枇杷叶、白前共 6 味药材为原料，经粉碎、过筛、混匀、包装等而成的散剂，具有润肺下气、止咳化痰之功效[1-3]。该临床验方有一定的临床疗效，拟开发成国家新兽药，但尚无统一的行业或国家质量标准。现行的中药散剂标准多从性状、鉴别、检查、浸出物等方面对中药散剂的质量进行控制，较少有涉及含量测定的内容[4]。因此，建立紫前款甘散简便可行的定性、定量检测方法，对制剂的质量进行全方位的控制显得尤为重要。基于此，本试验采用显微鉴别方法，对处方中的紫菀、前胡、甘草、款冬花、枇杷叶进行鉴别 ； 采用薄层色谱法(Thin layer chromatography, TLC)对处方中前胡、甘草、枇杷叶进行鉴别 ； 应用高效液相色谱法(High performance liquid chromatography,HPLC)对该处方的特征成分紫菀酮进行定量分析，旨在为其质量控制及质量标准的建立提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验药品与试剂 紫前款甘散，规格：500 g/袋，批号:2018061201、2018061202、2018061203。对照药材：前胡，批号：120951-201706，枇杷叶，批号：121261-201303，甘草，批号：120904-201519。对照品：白花前胡甲素，批号：111711-201703，含量以 98.8%计；白花前胡乙素，批号：111904-201203，含量以 98.0%计；熊果酸，批号：110742-201823，含量以 94.7%计，紫菀酮，批号：111581-201605；含量以 99.8%计，均购自中国食品药品检定研究院。

1.2 主要仪器 BX-53 型显微镜(奥林巴斯);Agilent 1200 型高效液相色谱仪；AL204 型电子天平(梅特勒-托利多公司)；CBIO-UV6 型多功能暗箱式紫外分析仪(北京赛百奥科技有限公司)；微量进样器(上海安亭微量进样器厂)；普通高速离心机(安徽科大创新股份有限公司)。

1.3 试验方法

1.3.1 性状 从颜色、形态、气、味等方面对紫前款甘散的性状进行观察。

1.3.2 显微鉴别 取过 4 号筛的样品适量，用水合氯醛(水合氯醛 50 g，加水 15 mL 和甘油10 mL 溶解)进行透化，根据各味中药的显微特征在显微镜下进行观察。

1.3.3 薄层鉴别 采用薄层色谱法(TLC)对处方中前胡、枇杷叶、甘草进行鉴别。

1.3.3.1 前胡的薄层鉴别 取本品3.25 g，加三氯甲烷 10 mL，超声处理 10 min，过滤，滤液蒸干，残渣加甲醇 5 mL 使溶解，作为供试品溶液。再取白花前胡甲素对照品、白花前胡乙素对照品，加甲醇制成每 l mL 各含0.5 mg的混合溶液，作为对照品溶液。吸取上述对照品溶液 5 μL，供试品3～10 μL 分别点于同一硅胶 G 薄层板上，以石油醚(60～90 ℃)-乙酸乙酯(3∶2)为展开剂，展开，取出，晾干，置紫外光灯(365 nm)下检视。

1.3.3.2 枇杷叶的薄层鉴别 取本品6.5 g，加甲醇 20 mL，超声处理 20 min，过滤，滤液蒸干，残渣加甲醇 5 mL 使溶解，作为供试品溶液。另取枇杷叶对照药材1 g，同法制成对照药材溶液。再取熊果酸对照品，加甲醇制成每1 mL 含1 mg的溶液，作为对照品溶液。吸取上述对照药材和对照品溶液各1 μL， 供试品1～2 μL，分别点于同一硅胶 G 薄层板上，以甲苯-丙酮(5∶1)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以 10%硫酸乙醇溶液，在 105 ℃ 加热至斑点显色清晰。

1.3.3.3 甘草的薄层鉴别 取本品13 g，加乙醚40 mL，加热回流1 h，过滤，弃去乙醚液，药渣加甲醇 30 mL，加热回流 1 h，过滤，滤液蒸干，残渣加水40 mL 使溶解，用正丁醇提取3次，每次20 mL，合并正丁醇液，用水洗涤3次，弃去水液，正丁醇液蒸干，残渣加甲醇5 mL 使溶解，作为供试品溶液。另取甘草对照药材1 g，同法制成对照药材溶液。吸取上述2种溶液各1～2 μL，分别点于同一硅胶 G 薄层板上，以三氯甲烷∶甲醇∶水(30∶10∶1)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以 10%硫酸乙醇溶液，在 105 ℃ 加热至斑点显色清晰，置日光下检视。

1.3.4 含量测定 应用高效液相色谱法(HPLC)测定紫前款甘散中紫菀酮的含量。

1.3.4.1 对照品溶液制备 精密称定紫菀酮对照品适量，加乙腈制成每1 mL含0.1 mg的溶液。

1.3.4.2 供试品溶液的制备 精密称定本品4 g，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇 25 mL，称定重量，40 ℃ 温浸1 h，超声处理(功率250 W，频率40 kHz)15 min，取出放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，过滤，取续滤液。

茄子具有生育期短、适应能力强、喜欢高温强光照、不耐高湿的特点。早春外界温度较低，光照不足，因此，茄子品种选择应该以早熟高产为目的。一般情况下，用于早春温室大棚播种的茄子应该选择生育期较短、对外界适应能力强、早熟稳产、耐弱光照、耐密植的优良茄子品种。

1.3.4.3 色谱条件 检测波长 200 nm，流动相乙腈-水(96∶4)为流动相，流速 1.0 mL/min，柱温 40 ℃， 理论板数按紫菀酮峰计算应不低于 3 500,进样量 20 μL，Agilent Eclipse Plus C18 色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)。

1.3.4.4 阴性供试品溶液制备 按处方比例及制备工艺制备不含紫菀药材的紫前款甘散，按供试品溶液制备方法制备阴性供试品溶液。

1.3.4.5 专属性考察 分别精密吸取上述对照品溶液、供试品溶液和阴性供试品溶液各20 μL，注入高效液相色谱仪检测。

1.3.4.6 系统适用性试验 按照 1.3.4.2 项下制备方法配制 6 份供试品溶液，按照上述色谱条件进行分析，记录色谱图。

1.3.4.7 线性关系考察 精密称定紫菀酮对照品10.0 mg，置 25 mL 量瓶中，以乙腈溶解并稀释制成 0.4 mg/mL 对照品储备液。用乙腈稀释制成 0.2、0.1、0.05、0.025 mg/mL 系列对照品溶液。上述各质量浓度对照品溶液按 1.3.4.3 项下色谱条件，分别进样 20 μL，记录色谱图，测定其峰面积。结果以对照品相应的质量浓度为横坐标(X,μg/μL)，对照品峰面积值为纵坐标(Y,mAU)，进行回归计算，得标准曲线方程。

1.3.4.8 重复性试验 对同一批号样品，按1.3.4.2 项下平行制备6 份供试液品溶液，按1.3.4.3项下色谱条件，分别进样 20 μL，测定。计算含量，求出紫菀酮的相对标准偏差(RSD)值。

1.3.4.9 稳定性试验 取本品按1.3.4.2中供试品液的制备方法，制备供试品溶液，分别于 0、2、4、8 h 和12 h 进样，记录色谱图，测定峰面积，求出RSD 值。

1.3.4.10 加样回收率试验 精密称取已知含量的同一批号样品2 g，共 6 份，置 25 mL 量瓶中，分别精密加入浓度为 0.114 9 mg/mL的对照品储备液 5.0 mL，加甲醇稀释至刻度，摇匀，0.22 μm 微孔滤膜滤过，各进样 20 μL，计算回收率。

2 结果

2.1 性状鉴别 本品为棕黄色至棕色的粉末，气微香，味甜、微苦。

2.2 显微鉴别 通过对紫前款甘散进行相关文献及试验研究，根据原生药材在成药处方中的君臣佐使，各检出特征在鉴定中的价值及检出的难易程度，选择特征唯一、有唯一对应药材、检出频率高的药材粉末特征作为紫前款甘散的显微鉴定依据。结果见中插彩版图1：紫菀：下皮细胞长方形，垂周壁波状弯曲，有的含紫色色素；前胡：木栓细胞淡黄色，常多层重叠，表观呈长方形；甘草：纤维束周围薄壁细胞含有草酸钙方晶，形成晶纤维；款冬花：花粉粒球形，直径约至 32 μm，外壁有刺，较尖；枇杷叶：非腺毛大型，单细胞多弯曲，完整者长约至1 260 μm。

图1 紫前款甘散的显微鉴别Fig.1 Microscopic identification of Ziqiankuangan powderA:紫菀，垂周壁细胞； B:前胡，木栓细胞； C:甘草，晶纤维； D:款冬花，花粉粒； E:枇杷叶，非腺毛A:Radix asteris,vertical wall cells; B:Radix peucedani,cork cells; C:Radix glycyrrhizae,crystal fiber; D:Flos farfarae, pollen grains; E:Folium eriobotryae, non-gland hairs

2.3 TLC 鉴别

2.3.1 前胡 供试品色谱中，在与对照药材色谱和对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。结果见中插彩版图2。

图2 前胡的薄层色谱图Fig.2 Thin-layer chromatography of Radix peucedani1：混合对照品； 2～4：供试品(批号：2018061201； 2018061202； 2018061203)； 5：阴性样品1:Mixed control sample; 2-4:Samples (batch number:2018061201; 2018061202; 2018061203); 5:Negative sample

2.3.2 枇杷叶 供试品色谱中，在与对照药材色谱和对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。结果见中插彩版图3。

图3 枇杷叶的薄层色谱图Fig.3 Thin-layer chromatography of Folium eriobotryae1：对照药材； 2：对照品; 3～5：供试品(批号：2018061201； 2018061202； 2018061203)； 6 阴性样品1:Control herbs; 2:Standard sample; 3-5:Samples (batch number:2018061201; 2018061202; 2018061203); 6:Negative sample

2.3.3 甘草 供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上,显相同颜色的斑点。结果见中插彩版图4。

图4 甘草的薄层色谱图Fig.4 Thin-layer chromatography of Radix glycyrrhizae1：对照药材； 2～4：供试品(批号：2018061201； 2018061202； 2018061203)； 5：阴性样品1:Control herbs; 2-4:Samples (batch number:2018061201; 2018061202; 2018061203); 5:Negative sample

2.4 专属性考察 结果显示，在上述色谱条件下紫菀酮峰与其他峰较好的分离，阴性样品溶液在紫菀酮相应的位置上无其他色谱峰的干扰，结果见图5。

图5 紫前款甘散 HPLC 色谱图Fig.5 HPLC chromatogram of Ziqiankuangan powderA：紫菀酮对照品； B：供试品； C：阴性样品A:Standard sample; B:Samples; C:Negative sample

2.5 系统适用性试验 结果表明，紫菀酮的理论塔板数均在 10 000 以上，保留时间的 RSD小于 2%，表明该法系统适用性良好，结果见表1。

表1 紫菀酮含量测定HPLC 法系统适用性分析Table 1 System suitability analysis for determination of shionone content by HPLC

2.6 线性关系考察 结果以对照品相应的质量浓度为横坐标(X,mg/mL)，对照品峰面积值为纵坐标(Y,mAU)，进行回归计算，得标准曲线方程Y=25.418X+39.375(r=1)。表明紫菀酮在 0.025～0.2 mg/mL 呈良好的线性关系，结果见图6。

图6 紫宛酮标准曲线Fig.6 The standard curve of shionone

2.7 重复性试验 结果显示，紫前款甘散样品的平均含量为 0.276 6 mg/g，RSD 为 1.98%，小于 2%，证明本含量测定方法重复性较好，结果见表2。

表2 紫菀酮含量测定重复性分析Table 2 Repeatability analysis for determination of shionone content

2.8 稳定性试验 结果显示，紫菀酮的峰面积 RSD 为 1.98%，该结果表明该溶液稳定性良好，结果见表3。

表3 紫菀酮含量测定溶液稳定性结果Table 3 Solution stability results for determination of shionone content

2.9 加样回收率试验 结果显示，平均加样回收率为100.17%，RSD值为1.77%，结果见表4。

表4 紫前款甘散中紫菀酮加样回收率试验Table 4 Test on the recovery rate of shionone in Ziqiankuangan powder

2.10 含量测定 根据峰面积计算紫菀酮平均的含量为 0.274 3 mg/g，RSD 值为 1.05%，结果见表5。

表5 供试品中紫菀酮含量测定Table 5 Determination of shionone content in the test product

3 讨论

现代药理学研究表明，紫菀、前胡、甘草、款冬花和枇杷叶具有止咳祛痰、平喘、抗炎、抗氧化等作用。由其组方所研制的紫前款甘散保持了原药材的性味与功效，具有不需煎煮、服用方便、吸收迅速、剂量准确、安全清洁、携带方便等特点，对紫前款甘散质量标准控制，从显微鉴别、薄层色谱鉴别、含量测定等指标进行，在文献报道[5-12]基础上，建立了紫菀、前胡、甘草、款冬花和枇杷叶的显微鉴别，以及前胡、甘草、枇杷叶的薄层鉴别，前胡的薄层色谱鉴别中，试验首先采用《中国兽药典》2015 版二部前胡药材项下收载的薄层鉴别方法以石油醚(60～90 ℃)-乙酸乙酯(3∶1)为展开剂[6]，比移值较低Rf=0.44，特征斑点不够清晰圆整，试验中尝试调整了极性相对较大的乙酸乙酯的比例，最终确定展开剂比例石油醚(60～90 ℃)-乙酸乙酯(3∶2)，展开系统的比移值适中Rf=0.69，分离效果好；在甘草原料药基础上开展了甘草的薄层考察[6]。试验对乙酸乙酯-甲酸-冰醋酸-水(15∶1∶1∶2)、三氯甲烷-甲醇-水(40∶10∶1)、甲苯-乙酸乙酯-甲醇(7∶3∶1)、三氯甲烷-甲醇-水(30∶10∶1)、甲苯-乙酸乙酯-冰醋酸(2∶2∶0.1)、甲苯-乙酸乙酯-甲醇(7∶3∶1)等展开剂进行了试验[5-6]，结果以三氯甲烷-甲醇-水(30∶10∶1)展开系统较佳，其斑点清晰可见，分离度好，阴性对照无干扰，方法验证可行。本试验还对紫菀、款冬花进行了薄层鉴别，采用不同的供试品制备方法、不同展开体系、不同显色剂和不同检视条件[6-7]。试验结果表明，薄层色谱斑点分离不好，尤其对照品斑点，并且阴性对照有干扰,效果不理想，因此紫菀、款冬花药材的薄层鉴别暂不作为该制剂的质量标准。

试验在文献报道[13-15]色谱条件基础上，对影响指标成分紫菀酮分离度和响应值的主要因素包括流动相、色谱柱、柱温、流速、检测波长进行了考察和优化。最终确定的色谱条件下，紫菀酮峰面积与进样量呈良好的线性关系，显示该方法对处方中紫菀酮的含量测定适用，分离度高、峰型好，阴性无干扰。

综上所述，本试验方法操作简单、准确、重复性好，可用于紫前款甘散的质量控制。